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Il gene P53 e le mutazioni

Una mutazione è un cambiamento nella sequenza del DNA di una cellula che può avvenire spontaneamente o essere provocato dall'esposizione a fattori mutageni (radiazioni, sostanze chimiche, ecc.). Le mutazioni possono essere dannose, benefiche o neutre. Se si verificano in una cellula qualsiasi dell’organismo vanno sotto il nome di mutazioni somatiche. Se compaiono in ovociti o spermatozoi, possono essere trasmesse alla generazione successiva e vanno sotto il nome di mutazioni germinali. Alcune mutazioni possono favorire la comparsa di cancro o di altre malattie. Estono numerose tipologie di mutazioni: quelle che interessano singoli nucleotidi sono dette mutazioni geniche; mutazioni che coinvolgono zone più o meno estese dei cromosomi sono dette mutazioni cromosomiche; mutazioni che alterano il numero dei cromosomi sono dette mutazioni genomiche.

Cosa sono le mutazioni?

Le mutazioni cromosomiche sono dei cambiamenti o errori che coinvolgono l’intero cromosoma o sue parti. Esse possono avvenire durante i processi di divisione cellulare ed essere trasmesse, di conseguenza, alle cellule figlie.Le mutazioni cromosomiche possono riguardare tutti i cromosomi: gli autosomi (nella specie umana si tratta delle coppie di cromosomi da 1 a 22); cromosomi sessuali (nella specie umana di tratta della coppia 23 di cromosomi). Le mutazioni cromosomiche possono riguardare vari fattori: il numero (cioè può esservi la perdita o l’acquisizione di uno o più cromosomi); la struttura (cioè vi sono delle rotture in uno o più cromosomi che portano ad una modificazione della struttura). Quando l’errore è a carico del numero di cromosomi si parla di: Aneuploidia - Quando vi è la perdita o l’acquisizione di una o più copie di un cromosoma (o di diversi cromosomi) Monoploidia - Quando vi è la perdita di un corredo cromosomico aploide Poliploidia - Quando vi è l’acquisizione di uno o più corredi cromosomici aploidi In particolare, per l’aneuploidia si distinguono: Monosomia - Se si perde un cromosoma di una coppia di omologhi. Trisomia - Se si acquisisce una copia in più di un cromosoma. Per la poliploidia si distinguono: Triploidia, - Quando viene acquisito un corredo aploide Tetraploidia - Quando vengono acquisiti due corredi aploidi Le mutazioni cromosomiche strutturali, invece, vengono classificate come: Inserzione o duplicazione - Se in un cromosoma vi è un pezzo aggiuntivo proveniente da un altro cromosoma o dallo stesso cromosoma; Delezione - Se in un cromosoma manca un pezzo; Inversione - Se un segmento di cromosoma si trova nell’orientamento opposto rispetto al normale; Traslocazione - Avvengono scambi di segmenti tra cromosomi diversi (cromosomi non omologhi). Le mutazioni cromosomiche possono avvenire nelle: Cellule germinali - In tal caso, possono causare patologie congenite o essere incompatibili con la vita. Cellule somatiche - Possono causare tumori.

Mutazioni cromosomiche

Le mutazioni geniche più comuni sono mutazioni puntiformi. Durante la duplicazione del DNA può essere aggiunto un nucleotide errato (sostituzione), possono essere inseriti uno o più nucleotidi (inserzione) oppure possono essere persi uno o più nucleotidi (delezione). L’effetto di queste mutazioni dipende dal punto del DNA in cui avvengono.

Mutazioni geniche

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Il termine “oncogene” fu utilizzato per la prima volta negli anni Sessanta del secolo scorso per indicare geni di origine virale in grado di causare il cancro. All’epoca i ricercatori ritenevano infatti che la causa della trasformazione di una cellula sana in tumorale fossero geni di virus che infettavano le cellule umane. Nel 1975 però, Bishop e Varmus scoprirono che gli “oncogeni” presenti nei virus oncogeni non avevano in realtà un’origine virale, ma erano presumibilmente entrati nel patrimonio genetico virale a partire da scambi con il genoma di cellule animali e umane. Proprio questa scoperta valse loro il premio Nobel. I prodotti proteici ottenuti da oncogeni e oncosoppressori sono diventati oggi bersagli di numerose terapie mirate. Esempi sono il trastuzumab, contro la proteina HER-2; il bevacizumab, contro il fattore di crescita vascolare VEGF; l’erlotinib contro il recettore del fattore di crescita epidermico EGFR). La comprensione delle funzioni di ciascuna di questi geni e proteine ha contribuito enormemente alla cura dei tumori. Se gli oncogeni sono l’acceleratore della cellula, gli oncosoppressori possono essere paragonati ai freni. Gli oncosoppressori sono geni coinvolti in genere nella divisione cellulare, nella riparazione degli errori che si possono generare nel DNA e nei processi di apoptosi (la morte cellulare programmata, fondamentale per permettere all’organismo di mantenersi sano). Come succede per gli oncogeni, anche gli oncosoppressori possono a un certo punto mutare e perdere la funzione di freno, dando il via al processo di formazione del tumore. C’è però una differenza fondamentale tra oncogeni e oncosoppressori: i primi diventano pericolosi per la cellula quando mutando o per stimolazione eccessiva sono costantemente attivati, mentre i secondi possono dare origine ai tumori quando vengono eliminati o inattivati. L’oncosoppressore più noto è p53, presente in forma alterata nel maggior numero di tumori umani e non solo. La proteina prodotta da questo gene è stata identificata nel 1979 e per una decina di anni si è pensato che p53 fosse un oncogene. Solo nel 1989 i ricercatori giunsero a una svolta arrivando a comprendere che si trattava in realtà di un oncosoppressore, in grado, quando non presenta alterazioni, di difendere il DNA. Non per niente ancora oggi si può leggere in alcuni libri di testo che p53 è “il guardiano del genoma”.

Tumori e mutazioni

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La sindrome di Li-Fraumeni (LFS) è un raro disordine autosomico dominante che aumenta notevolmente il rischio di sviluppare diversi tipi di cancro, in particolare nei bambini e nei giovani adulti, come il sarcoma dei tessuti molli, l'osteosarcoma, il cancro al seno pre-menopausa, i tumori cerebrali, il carcinoma adrenocorticale (ACC) e la leucemia. Inoltre si può sviluppare una varietà di altre neoplasie. Tumori multipli e tumori legati alla LFS sono spesso prodotti nell'infanzia o da giovani adulti e i sopravvissuti hanno un rischio maggiore di vari tumori primari. La LFS viene diagnosticata in individui che soddisfano i criteri clinici stabiliti o in quelli che hanno una variante patogena germinale nel TP53, indipendentemente dalla storia familiare di cancro. Almeno il 70% degli individui diagnosticati clinicamente hanno una variante patogena germinale identificabile in TP53, l'unico gene finora identificato in cui la mutazione è definitivamente associata alla LFS. Sono difficili da stimare le cause della LFS. È difficile stimare l'incidenza di questa rara malattia poiché la sua definizione solleva un problema di classificazione nosologica. I tumori più caratteristici sono gli osteosarcomi, i sarcomi dei tessuti molli, il cancro al seno nei giovani, la leucemia/linfoma, i tumori cerebrali e l'adenocarcinoma; tuttavia, si può osservare qualsiasi tipo di tumore. La mutazione germinale del gene TP53 si trova nel 70% delle famiglie con LFS, così come in alcune famiglie o pazienti con modelli suggestivi della malattia, anche senza soddisfare strettamente i criteri. Il rischio di un portatore di una mutazione deleteria sul gene TP53 di sviluppare il cancro è del 15% a 15 anni di età, dell'80% per le donne di 50 anni e del 40% per gli uomini della stessa età. La differenza significativa tra i sessi può essere spiegata quasi completamente a causa del cancro al seno. Il rischio di sviluppare un secondo cancro, specialmente un tipo indotto da radiazioni, è alto. La LFS classica è diagnosticata quando una persona ha tutti i seguenti criteri: Un sarcoma diagnosticato prima dei 45 anni Un parente di primo grado, cioè un genitore, un fratello o un figlio, con qualsiasi cancro prima dei 45 anni

Sindrome di Li Fraumeni

Legenda

Anamnesi familiare di Valery

In ospedale arriva la signora Valery, le è stato consigliato di eseguire degli esami da un oncologo, a seguito di una mammografia in cui si è riscontrata la presenza di una massa. Successivamente a questi esami, è stata confermata la presenza del cancro nella paziente. Dopo aver eseguito l'anamnesi familiare, si riscontra che la maggior parte dei parenti stretti di Valery da parte di madre hanno avuto il cancro. Si sospetta la presenza della mutazione del gene P53, meglio conosciuta come LFS. A questo punto Valery richiede degli esami specifici per assicurarsi che i i suoi figli non corrano rischi.

Caso n° 1

Per il processo di elettroforesi in cui analizzeremo il gene p53 utilizzeremo: il sangue periferico di Valery, il tessuto tumorale del seno ed il tessuto sano del seno. Il gene p53 della paziente sarà tagliato con un enzima di restrizione. A questo punto si passa alla preparazione di un gel all'0,8% e verrà successivamente caricato con: - Frammenti standard di dna - Dna di controllo ( gene non mutato) - DNA sangue periferico di Valery - DNA tessuto tumorale del seno di Valery - DNA tessuto sano di Valery

Elettroforesi

Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido nucleico. Nel 1977 venne sequenziato l’intero genoma del batteriofago ΦX174, lungo oltre cinquemila basi e fu utilizzato un nuovo metodo di sequenziamento messo a punto da Sanger, che usava per la prima volta i nucleotidi terminatori di catena. Nasce così il metodo che relega in soffitta il laborioso protocollo precedentemente usato da Maxam e Gilbert e apre la strada a una nuova era della ricerca genetica. il metodo Sanger sfrutta la capacità della DNA polimerasi di copiare la sequenza e sintetizzare un nuovo filamento complementare. La novità introdotta da Sanger consiste nell’impiego dei nucleotidi terminatori di catena, ovvero didesossinucleotidi (ddNTP): rispetto ai nucleotidi usati dalle cellule per la sintesi del DNA, i ddNTP sono privi del gruppo 3’-OH dello zucchero, che è necessario per formare il legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo. Una volta incorporati nella catena nascente di DNA, i ddNTP causano l’interruzione della sintesi. Al procedere della reazione, vengono incorporati nel nuovo filamento sia dNTP normali, che permettono alla reazione di proseguire, sia ddNTP che bloccano la sintesi: al termine della reazione, si avrà una miscela di filamenti con lunghezza diversa.

A questo punto della ricerca Valery decide di sottoporre i suoi figli al sequenziamento del DNA ( per il momento sani) per assicurarsi che non ci sia la presenza della mutazione.

Sequenziamento del DNA

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Sequenziamento di DNA

Alessandra Lucchese Maria Cristina Consiglio

Grazie per l'attenzione