TP maladies nosocomiales

TP Une infection nosocomiale à l'hopital !

Vous êtes un-e biologiste indépendant-e, spécialiste des maladies nosocomiales. Votre équipe est appelée sur le terrain pour connaître la source de cette contamination et pouvoir la combattre.

Le professeur Strauss est tombé gravement malade suite à son hospitalisation pour une chirurgie de la prostate. Pendant l’opération, on a dû l'intuber avec une sonde trachéale... On suspecte alors une contamination par une bactérie résistante : Escherichia coli résistante à l’ampicilline (un antibiotique normalement très efficace) Le directeur veut savoir si la contamination est due à du matériel ou du personnel hospitalier car en cas de décès, sa responsabilité est engagée !

Comment "attrape"-t'on une infection nosocomiale ?

Les infections nosocomiales sont des infections contractées dans des établissements de santé, comme les hôpitaux par exemple."Santé publique France" estime qu'un patient hospitalisé sur 20 en a contracté en France en 2017. Beaucoup d'entre eux ne guérissent pas malgré les traitements antibiotiques car les bactéries attrapées sont devenues résistantes...

Les infections nosocomiales

Votre équipe travaille par étapes

1 identifier la bactérie responsable de l'infection du Dc Strauss

2 identifier le gène de la résistance à l'ampicilline

3 lister les sources de contamination possible

4 détecter le gène dans une des sources probables de contamination

5 proposer une solution au directeur pour sauver Dc Strauss

Contextualize your topic

D'après mes premières observations issues d'un échantillon urinaire du Dc Strauss, il s'agit bien d'une Escherichia coli

Escherichia coli

La bactérie est devenue résistante par mutation aléatoire d'un de ces gènes : dans le cas étudié ici, c'est le gène AmpR+ qui rend la bactérie résistante à l'ampicilline.

Cet ADN circulaire est capable de se répliquer et peut être transféré à d’autres microbes. → on se propose de détecter cet ADN circulaire contenant le gène AmpR dont la taille fait 1000 pb (paire de bases). On utilise pour cela 2 techniques : - technique « PCR » pour amplifier cet ADN (car si les prélèvements contiennent de l’ADN, ça sera en très petite quantité). - l’électrophorèse pour identifier le gène.

Ce gène se situe dans le plasmide de la bactérie. C'est un ADN circulaire en plus de leur ADN chromosomique.

Pour détecter la bactérie résistante à l'ampicilline , il faut donc détecter le gène AmpR+ de la bactérie .

Identifiez les patient-e-s qui pourraient être contaminé-e-s par la bactérie résistante et les sources de contamination. → appelez l’enseignante pour valider et obtenir le code du laboratoire.

Nous avons réalisé un questionnaire parmi les patients afin de déterminer les sources possibles de contamination par une bactérie résistante à l’ampicilline. Nous cherchons parmi nos patient-e-s, ceux ou celles qui ont été traité-e-s par antibiotique et dont l’état de santé ne s’est pas amélioré

Code accès labo ?

taper en majuscules

code accès labo ?

taper en majuscules

• Vérifier que la paillasse est propre et dégagée
• ne pas toucher les extremites des cônes des propipettes (revoir leur utilisation ici)
• les microtubes de prélèvements sont maintenus au froid
• limiter le temps d'ouverture de ces tubes pour ne pas les contaminer

Consignes de sécurité pour ne pas contaminer les tubes à tester

étape 1A : préparation des différents tubes à répliquer au thermocycleur

Les groupes passent à tour de rôle sur la paillasse PCR en respectant l'ordre des lettres. Un seul élève du groupe manipule la PCR pour éviter les contaminations. (les autres auront une autre tâche plus tard!)

Chaque groupe fait le test qui lui est attribué, le résultat sera collectif. Les tests sont réalisés en double pour plus de fiabilité des résultats.

étape 1A : préparation des différents tubes à répliquer au thermocycleur

prélever 2 uL d'ADN à amplifier du prélèvement qui vous a été attribué (mme Pivoine par exple) et le verser dans le tube PCR. Mélanger par pipetage doux.

prélever 20 uL d'amorce AMP et les verser dans le microtube PCR. Mélanger par pipetage doux. Changer de cône de micropipette.

préparer un microtube PCR 0.2 mL en faisant un repère sur le bouchon pour identifier l'échantillon testé

prélever 20 uL de PCR mix et les verser dans le microtube PCR. Changer de cône de micropipette.

Préparer le tube réactionnel : exemple de Mme Pivoine

Bien lire les étapes avant de commencer !

étape 1A : préparation des différents tubes à répliquer au thermocycleur

Refermer rapidement le tube. On utilisera plutôt une pression verticale ferme mais modérée, entre le pouce et l'index en évitant les pressions latérales.

Ranger la paillasse et passer à l'étape 1B.

Noter la position de votre tube dans le thermocycleur pour pouvoir le récupérer à la fin des réplications.

Cette amplification nécessite plusieurs étapes résumées dans cette vidéo. Prenez des notes pour expliquer l'objectif de chaque étape (dénaturation, hybridation, polymérisation ou élongation) dans votre compte-rendu final.

Cycle x 12

Cycle 12 Exp : 30 min

Etape réalisée par la cheffe du laboratoire

Une fois tous les tubes dans le thermocycleur, on lance l'amplification:

étape 1B :comprendre le fonctionnement de la PCR

Pour votre équipe, il est temps de communiquer le protocole de vos recherches afin de sauver Dc Strauss ! (document LibreOffice) 1) rappeler l'objectif du TP et définir la maladie nosocomiale dont est atteint Dc Strauss 2) identifier les sources susceptibles de l'avoir contaminé 3) expliquer les étapes de la PCR 4) rappeler le mécanisme de la réplication qui justifie le besoin d'une amorce 5) au bout de 12 cycles, combien d'exemplaires du gène résistant seront présents dans les tubes positifs?

Protocole de détection du gène AmpR+ étape 1 : la PCR / compte-rendu

La PCR est terminée ?

SUITE du protocole :

Un petit schéma pour vous aider?

Si besoin, rappel du principe de l'électrophorèse ici !

Chaque groupe récupère son tube dans le thermocycleur et un élève du groupe va réaliser le dépot comme indiqué dans la page suivante.

Pour identifier la présence du gène Ampr+ et en déduire la contamination par la bactérie E.coli résistante à l'ampicilline , il faut réaliser une électrophorèse avec les prélèvements amplifiés par la PCR.

Protocole de détection du gène AmpR+ étape 2: l'électrophorèse

Un élève par dépôt

Noter les résultats à intégrer au compte-rendu

Dépot dans le puits indiqué

Protocole électrophorèse:

- Proposer un antibiogramme avec les 4 antibiotiques à votre disposition . - Appeler la professeure pour valider et réaliser l'expérience.

Un antibiogramme est une technique de laboratoire visant à, tester l sensibilité d'une bactérie à un ou plusieurs antibiotiques.

L'ampicilline n'étant plus efficace sur Dc Strauss, il faut trouver un autre un antibiotique efficace contre la bactérie E.coli. Pour cela, votre équipe a le matériel nécessaire à la réalisation d’un antibiogramme :→ une boîte de pétri avec gélose ensemencée par la souche bactérienne présente chez Dc Strauss → 4 antibiotiques : 1 = ampicilline 2 = céfoxitine 3 = gentamicine 4 = amoxicilline

Quelle solution pour sauver Dc Strauss? étape 1 : recherche d'une stratégie

TP PCR.prénoms

Pour votre équipe, il est temps de terminer la communication de vos résultats :(suite du CR) 6) indiquer , sous la forme de votre choix, les résultats de l'électrophorèse avec titre et légende 7) identifier la source de contamination du Dc Strauss 8) coller la photo des résultats de l'antibiogramme avec titre et légendes 9) proposer un antibiotique efficace pour guérir le patient 10) conclure votre enquête par des conseils que vous donneriez au directeur de l'hopital pour éviter que cette contamination ne se reproduise ? Enregistrer votre CR dans restitution des devoirs:

Quelle solution pour sauver Dc Strauss? étape 2: identification de l'antibiotique efficace