GENIAL ESCAPE ROOM

Escape Room Da Transcrição Inversa

Feito pelo Daniel Oliveira e Helena Camões (12ºB)

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Introdução

Neste jogo, vamos percorrer as estapas necessárias para que ocorra a transcrição inversa. Este processo é útil no nosso projeto, pois, para amplificarmos certos genes, precisamos de DNA.

Na transcrição inversa é formada uma cadeia de DNA complementar (cDNA) a partir de RNA (mRNA). Para atingirmos o nosso objetivo final (obter cDNA) precisamos de:

• Provocar a lise celular (que fizemos na terceira semana);
• Separar o RNA (que fizemos na quinta semana);
• Lavar o RNA (que fizemos na sexta semana);
• Dissolver o RNA (que fizemos na sexta semana);
• Converter o RNA em cDNA (que fizemos na sexta semana).

+ info

Etapas

Para concluires o "escape room" tens de completar cada etapa!

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

6ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

1ª Etapa

Durante quanto tempo podemos guardar as placas depois desta etapa?

Durante um ano (a -70ºC) ou durante um dia (a 4ºC).

Apenas durante um dia (a -70ºC).

Etapas

Para concluires o "escape room" tens de completar cada etapa!

2ª Etapa

1ª Etapa

3ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

4ª Etapa

2ª Etapa

O que podemos concluir a partir da visualização deste vídeo?

As ribonucleases (RNAses) são muito fracas, logo uma enorme quantidade de RNAses não compromete os nossos resultados.

As ribonucleases (RNAses) são muito resistentes. Para além disso, uma quantidade muito reduzidade de RNAses no nosso ambiente de trabalho pode comprometer os nossos resultados.

Etapas

Para concluires o "escape room" , tens de completar cada etapa!

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

3ª etapa

Sabendo que o isopropanol pertence à família dos alcoóis, que imagem corresponde à fórmula química do isopropanol?

Etapas

Para concluires o "escape room", tens de completar cada etapa!

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

Sexta etapa

Test 6

Por que razão centrifugamos as amostras nesta etapa?

Como o RNA é mais denso, ele irá ficar na parte superior do eppendorf, o que torna mais fácil a sua remoção.

Como o RNA é mais denso, ele irá ficar na parte inferior do eppendorf. Depois de descartarmos o sobrenadante e de deixarmos evaporar os restos de sobrenadante que possam existir, teremos a nossa amostra de RNA (que iremos utilizar na próxima etapa)

Etapas

Para concluires o "escape room", tens de completar cada etapa!

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

4ª etapa

Presta atenção a esta imagem.Agora, indica se a afirmação seguinte é verdadeira ou falsa "Esta solução garante a pureza do RNA"

Falso

Verdadeiro ✓

Etapas

Para concluires o "escape room", tens de completar cada etapa!

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

6ª Etapa

5ª Etapa

4ª Etapa

6ª etapa

Cada componente pertence a uma Mix. Arrasta o componente para o quadrado da Mix a que pertence.

Master Mix

Enzyme Mix

1.Primers

2.dNTPs

3.Reverse Transcriptase

4.MgCl2

5.RT buffer

6.Inibidor de Ribonucluease

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Solución

SOLUção

Parabéns

Terminaste o Escape Room! Agora é o expert da transcrição inversa!!

Queres começar de novo?

Oh oh!

Essa resposta não está correta...

Mas não desanimes! Volta a tentar.

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Aqui está o link de um vídeo que explica de uma forma resumida o processo de formação do cDNA.https://youtu.be/rKPJpxCW2qw?si=znkV4W2VGvypAu2H (consultado em 20/03/2024)

Link da imagem

https://www.mercedesscientific.com/buy/product/depc-treated-water/CLENCe589e8c2555c5821fde6121f5375f1d5 (consultado a 22/03/2024)

Transcrição inversa

Protocolo:

• Misturar num tubo de falcon 286 μL de Master Mix e 57,2 μL de Enzyme Mix;
• Num eppendorf de maior capacidade,escrever na tampa "Mix";
• No eppendorf "Mix" colocar a mistura do tubo de falcon e 8 μL de "DEPC-treated water"
• Em cada tubo numerado de 1-24 introduzir 12 μL da mistura que estava no eppendorf "Mix";

• Escrever "RNA" no tubo 25;
• Introduzir 10 μL de Master Mix, 2 μL de "DEPC-treated water" no eppendorf "RNA";
• Escrever "H2O" noutro eppendorf de 200 μL e adicionar 12 μL de "DEPC-treated water".
• Colocar os 26 eppendorfs no termociclador e colocar no programa "Bio-RAD T100 Thermal Cycler".

Objetivo: tornar RNA em cDNA.

Webgrafia das imagens

1: https://sielc.com/compound-1-3-propanediamine (consultado a 20/03/2024)2:https://www.fishersci.co.uk/shop/products/isopropanol-extra-pure-slr-fisher-chemical/11428782 (consultado a 20/03/2024) 3:https://www.chemspider.com/Chemical-Structure.175.html (consultado a 20/03/2024)

"Lavagem" do RNA

Protocolo:

• Centirfugar os eppendorfs a 13000 rppm durante 15 minutos a 4ºC e retirar sobrenadante;
• Misturar num falcon 35 ml de etanol e 15 ml de água;
• Introduzir 400 μL da solução criada no passo anterior em cada eppendorf;
• Centrifugar os eppendorfs durante 10 minutos a 10 000 rppm e 4ºC;
• Descartar 400 μL de sobrenadante;
• Deixar evaporar o restante do sobrenadante.

Objetivo: o etanol promove a precipitação do RNA, enquanto os contaminantes permanecem em solução, logo garantimos que a nossa amostra de RNA não está contaminada

Esclarecimentos

• dNTPs: desoxirribonucleotídeos trifosfato, nucleótidos de DNA formados por uma base azotada, um açúcar e 3 grupos fosfato (trifosfato);
• MgCl2: estabiliza o cDNA e ativa a enzima Taq polimerase, que é responsável por sintetizar DNA com a ajuda de um primer a tempreaturas elevadas, a partir de cadeias simples;
• RT buffer: Reverse Transcriptase buffer. Otimiza a ação da enzima Reverse Transcriptase

• Primers: segmentos de ácidos nucleicos necessários para a replicação do DNA;
• Reverse Trancriptase: enzima necessária para a "transformação" do RNA em cDNA;
• Inibidor de Ribonuclease: inibe a ação de ribonucleases, que são enzimas que catalisam (aceleram) a degradação do RNA.

Webgrafia: https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/reverse-transcription (consultado a 23/03/2024)

Separação

Protocolo:

• Colocar o que se encontra em cada poço num eppendorf (os eppendorfs foram numerados, previamente, de 1 a 25);
• Transferir 100 μL de NZYol para cada poço;
• Transferir 80 μL de clorofórmio para cada poço;
• Colocar os eppendorfs no vortex durante 15 segundos;
• Colocar os eppendorfs no gelo durante 15 minutos;
• Colocar os eppendorfs na centrifugadora durante 15 minutos;
• Recolher 100 μL da parte superior (RNA em solução aquosa);
• Colocar o que foi recolhido em novos tubos numerados de 1-25.

Objetivo: obter o RNA em solução aquosa. Após a centrifugação, a mistura do NZYol com o clorofórmio irá provocar a separação da solução em várias fases, nomeadamente:

• A superior, que contém o RNA em solução aquosa;
• A intermédia, que contém DNA e proteínas;
• A inferior, que contém compostos orgânicos.

Nota

Precipitação do RNA

Protocolo:

• Adicionar 150 μL de isopropanol a cada eppendorf;
• Colocar as amostras a -20ºC durante 10 minutos;
• Centrifugar a 12000g duarante 10 minutos a 4ºC
• Descartar o sobrenadante com uma pipeta;

Objetivo: precipitar o RNA (o isopropanol provoca a sua precipitação. Como o nosso objetivo final é converter RNA em cDNA, esta etapa é fundamental.

Master Mix

1 2 4 5

Enzyme Mix

3 6

Lise e homogeneização

Protocolo:

• centrifugar as placas que têm estímulos (preparadas em sessões anteriores) na centrifugadora;
• transferir 80 μL de cada dessas placas para outras placas com poços redondos;
• colocar 100 μL de NZYol em cada poço das novas placas

Objetivo deste passo:O NZYol provoca a lise e homogeneização das células, mas preserva o RNA que é essencial para a transcrição reversa.

Lavagem do RNA

Para garantirmos a pureza do RNA, nós utilizamos "DEPC-trated water" que é uma solução aquosa que inativa as enzimas RNAses.Assim, na próxima etapa (conversão de RNA em cDNA), iremos incluir "DEPC-treated water" .

Objetivo: garantir a pureza do RNA