PCR

PCR

Uma técnica de engenharia genética

Mafalda Castro nº13 12ºCT3 No âmbito da disciplina de Biologia Escola Secundária de Caneças Ano letivo 2023/2024

A engenharia Genética

É o ramo da engenharia que engloba o conjunto de técnicas que permitem a manipulação do material genético de um organismo vivo.

A Técnica PCR

É uma técnica que ocorre in vitro e permite a produção rápida de milhões de cópias de um segmento específico de DNA usando uma polimerase de forma cíclica, onde se duplica o número de moléculas de DNA.

O Necessário:

• DNA polimerase;
• Amostra de DNA;
• Primers de DNA;
• Nucleótidos livres;
• Solução-tampão.

DNA polimerase: enzima que permita a produção de novas cadeias de DNA;

Primers de DNA: sintetizados quimicamente, são necessários para iniciar o processo de replicação do DNA (ao ligarem-se apenas a sequências exatas de DNA, permitem determinar com exatidão a região a ser amplificada).

Primer de DNA

Amostra de DNA: previamente isolada e purificada a partir de células ou tecidos;

Solução-tampão: apresenta iões Mg2+, necessários à atividade da DNA polimerase;

Todo o procedimento laboratorial é realizado com o auxílio de um termociclador, instrumento que executa automaticamente a PCR.

PROCESSo

Terceira fase

Primeira fase

Segunda fase

Ação da DNA polimerase

Desnaturação do DNA

Ligação dos primers

Desnaturação do DNA

• A solução é sujeita a temperaturas muito elevadas, na ordem dos 95ºC;

• O aumento de temperatura vai permitir a quebra dos pontos de hidrogénio que existem entre as bases complementares das duas cadeias da molécula de DNA;

• Originam-se assim 2 cadeias simples de DNA.

Ligação dos primers

• A mistura é arrefecida para temperaturas entre os 45 e os 65ºC, dependendo do primer que será utilizado;

• Permite-se a ligação do primer à extremidade 3’ da cadeia-molde a ser ampliada por complementaridade de bases.

Ação da DNA polimerase

• A mistura volta a ser aquecida, desta vez a 72ºC, a temperatura ótima para a ação da DNA polimerase;

• A enzima vai sintetizar uma nova cadeia de DNA por complementaridade de bases.

Taq polimerase

A técnica PCR recorre à utilização de temperaturas bastante elevadas que a DNA polimerase humana não consegue suportar, desnaturando-se;

De modo a reduzir os custos de ter de adicionar uma nova DNA polimerase após cada ciclo, começaram a ser usadas Taq polimerases.

Taq polimerase

São enzimas que permitem a síntese do DNA;

Como provêm de bactérias termófilas (Thermus aquaticus) resistentes a temperaturas muito elevadas não desnaturam com as temperaturas exigidas para a polimerização do DNA.

Inovação do Pcr

Recentemente esta técnica inclui também a utilização de moléculas fluorescentes que permitem a quantificação dos produtos da PCR em tempo real.

Inovação do Pcr

Quando as moléculas fluorescentes se ligam ao DNA que vai sendo produzido, a sua fluorescência aumenta, sendo proporcional à quantidade de DNA existente.

Obrigada!