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Resultados

Para a formação e caracterização dos complexos, utilizaram-se soluções de NPAu’s com diferentes tamanhos de partículas, uma solução de pDNA purificado, duas soluções de sulfato de protamina de concentração 10 e 1,0 mg/mL e solução tampão Hepes, de concentração 40 mM e pH 6,5. Cinco proporções mássicas de pDNA, protamina e NPAu’s foram escolhidas para serem utilizadas na formação de diferentes complexos ternários. Variando as características das NPAu’s em paralelo testou-se também a sua influência na formação e características de tamanho e potencial zeta dos complexos. Para cada complexo, adicionou-se um determinado volume de tampão de modo a obter 50 microlitros de complexo, obtendo-se 1 micrograma de pDNA e a proporção desejada de protamina. Antes de adicionar as NPAu’s, incubámos o pDNA, a protamina e o tampão por 10 min e só depois é que se adicionou o volume necessário para atingir a proporção desejada de ouro e incubou-se por mais 10 min. Por fim, 950 microlitros de água foram adicionados e o volume total de 1 mL de complexo foi transferido para as cubetas de análise de diâmetro no DLS e outro complexo com as mesmas proporções foi formado para ser submetido à análise do potencial zeta.

Discussão

Conclusão

O tamanho das nanopartículas de ouro influenciam as características dos complexos ternários , assim, nanopartículas de maior tamanho causam uma diminuição no diâmetro dos vetores formados, bem como um aumento no potencial zeta, na maioria das vezes. Além disso, através da quantificação por citometria de fluxo da expressão da proteína repórter GFP, contida no pDNA, será possível determinar o nível de transfecção alcançado pelos complexos. Assim, espera-se obter relações que permitam compreender como essas características influenciam o transporte do complexo do exterior da célula até à sua entrada no núcleo.

Com o intuito de comparar a eficiência da entrega génica das nanoparticulas, procurou-se testar diferentes tamanhos das partículas NPau’s. Conclui-se que tanto para valores maiores como para o menor da concentração de citrato de sódio os diâmetros das nanopartículas apresentam maior valor. Concluiu-se também que para quantidades baixas de citrato de sódio, há um aumento considerável no valor do potencial zeta, chegando a valores positivos e, após uma acentuada diminuição, ocorre uma nova perda de estabilidade, com proporções molares maiores e valores de potencial zeta mais próximos de zero. Tal efeito é interessante ao permitir a formação de nanopartículas de diferentes tamanhos e potenciais zetas próximos. A partir das características obtidas em diferentes sínteses de NPau's, foram escolhidas duas para a formação e caracterização dos complexos ternários. Desta forma, foi possível estudar o efeito que o tamanho das nanopartículas de ouro possui sobre os complexos. A tabela 1 apresenta o diâmetro hidrodinâmico médio, como os valores de diâmetro das nanopartículas de ouro apresentaram leves variações de síntese para síntese, os valores exatos para as NPau´s utilizadas são apresentados juntamente com a tabela.

Bibliografia

M. M. Palma, C. H. S. Santos, S. Schiavon1, M. Seckler, R. Azzoni ; Desenvolvimento e avaliação de nanoparticulas DNA-Protamina-Au para a entrega de DNA em estudos de terapia e vacinação génica, 2016

Formação dos Complexos Ternários pDNA-protamina-NPAu

Purificação do DNA Plasmidial:

Para a formação dos complexos ternários pDNA-protamina-NPAu, foi utilizado o plasmídeo modelo pVAX1GFP. O pDNA foi desenvolvido para vacinas de DNA e contém um promotor do citomegalovirus humano (CMV), gene repórter da proteína verde fluorescente, gene de resistência à Kanamicina e origem de replicação procariota pMB1.

Introdução

A terapia genética é um tratamento que consiste em um conjunto de técnicas que provocam alterações em genes de interesse para promover modificações e/ ou interferir na ação de genes que estão inativos ou que prejudicam os organismos. Para que isso ocorra de forma bem-sucedida, é necessário um veículo chamado vetor, para facilitar a entrada de DNA nas células. O vetor é determinado pelos seguintes fatores: o tipo de doença que se pretende tratar, o tipo de célula que se pretende atingir e tendo em consideração a necessidade de expressão do gene de interesse, longo ou a curto prazo. Existem três categorias principais de vetores, que continuam a ser aprimorados:os vetores virais, vírus que podem ser manipulados para perder essas características, os plasmídeos (pequenos segmentos de DNA) e os vetores nanoestruturados.

Gráfico 2 Potencial Zeta de NPAu´s

Gráf. 1 Diâmetro hidrodinâmico de NPAu´s

Tabela 1

Metodologia

Síntese das Nanopartículas de Ouro:

Para sintetizar as nanopartículas de ouro utilizou-se 95 mL de uma solução de 0,267 mM de cloreto de ouro (III) trihidratado. Esta foi aquecida até atingir o seu ponto de ebulição (100º) e de seguida adicionou-se 5 mL de uma solução de 34 mM de citrato de sódio tribásico dihidratado. Passados 15 min deixou-se o ouro coloidal resfriar a temperatura ambiente. Por fim, completou-se o volume do líquido evaporado com água, obtendo-se uma solução aquosa de concentrção 5 mg/dL. A fim de se obter nanopartículas de ouro com diferentes características de tamanho e potencial zeta, variou-se a quantidade de citrato de sódio adicionada. Testaram-se diversas relações molares para estudar o efeito da adição de diferentes proporções do agente redutor, sobre o diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) e carga superficial das NPAu's, medidos através da técnica DLS (espalhamento dinâmico de luz e PZ (potencial zeta). Para concentrar as nanopartículas sintetizadas que foram usadas nos complexos ternários, alíquotas de 1 mL foram centrifugadas a 10.000g por 45 min, a 4 ºC. Ao fim deste tempo, retiraram-se 800 microlitros do sobrenadante. O volume restante foi vortexado de modo a ressuspender as nanopartículas e obter uma solução cinco vezes mais concentrada.

Objetivos

O intuito deste estudo é compreender a formação de nanopartículas de ouro, protamina e DNA plasmidial destinados à entrega génica. Assim, pretende-se avaliar a síntese de nanopartículas de ouros com diferentes tamanhos e potencial zeta usados para a criação dos vetores desejados, permitindo, então, correlacionar as suas propriedades físico-químicas com o potencial de entrega génica de células cultivadas in-vitro.

Resumo

Palavras-chave: DNA-Protamina-AU, citrato de sódio, vetores plasmidiais, nanopartículas.

Este trabalho propõe o desenvolvimento de novos vetores não virais para entrega génica, visando superar as barreiras encontradas na terapia genética e no desenvolvimento de vacinas de DNA. Os vetores são compostos por DNA plasmidial (pDNA), nanopartículas de ouro (NPAu) e protamina, formando complexos ternários. As NPAu foram sintetizadas com diferentes diâmetros e potenciais zeta por redução com citrato de sódio. Os vetores foram caracterizados por tamanho e potencial zeta, variando de acordo com as proporções de cada componente e condições de síntese. O próximo passo é avaliar a eficiência dessas nanopartículas na transfecção de células in vitro, para determinar a sua capacidade de entrega de material genético.

Bactérias E. Coli modificadas com o plasmídeo foram cultivadas em balões Erlenmeyer , que continham 150 mL de meio Luria-Bertani e Kanamicina (30 g/mL) sob agitação . Após o crescimento, o pDNA foi recuperado e purificado e determinou-se a concentração e o grau de pureza da solução que continha o plasmídeo. A concentração obtida foi de 394 ng/L e a razão de absorbância foi de 1,95, evidenciando assim um elevado grau de pureza.

Fig.1 Composição do plasmídeo

12º A Beatriz Fernandes Laura Gradim Marisa Gonçalves Rodrigo Tomaz

Terapia e vacinação génica: Nanopartículas de pDNA-Protamina-AU