Diario de misión

Técnica de preparación de muestra Liquidas o solidas en disolución.

Compuestos de interés retención sobre un adsorbente sólido Separación (analitos) (fase solida estacionaria) Interferentes de la matriz que no son retenidos. - Diferencia de afinidad entre analitos e interferentes, presentes en una matriz, por el sorbente - Se realiza en cartuchos o columnas. Estos cartuchos contienen un material adsorbente (relleno). - La selectividad de la extracción está relacionada con la capacidad del adsorbente de discriminar entre los analitos de interés y el resto de compuestos de la matriz o interferentes. Los materiales adsorbentes pueden clasificarse en: Adsorbentes hidrofóbicos Adsorbentes hidrofílicos Adsorbentes de afinidad Adsorbentes mixtos Adsorbentes de intercambio iónico

ETAPAS

GLOSARIO

BIBLIOGRAFÍA

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Acondicionamiento y equilibrado Acondicionamiento: eliminar cualquier posible impureza y solvatar el adsorbente. Permitirá al adsorbente interactuar de forma más efectiva con el analito. Equilibrado: eliminar el exceso del disolvente y tratar el relleno del cartucho con una disolución similar a la matriz de la muestra. para maximizar la retención del analito en el adsorbente.

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Carga de la muestra Introducir la muestra en el cartucho que contiene el adsorbente acondicionado y que permite que los analitos de interés sean retenidos en el relleno. Algunos componentes de la matriz pueden pasar por el cartucho sin ser retenidos. Otros pueden retenerse más o menos fuertemente en la superficie del adsorbente.

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Lavado Eliminar selectivamente las interferencias no deseadas, que no se han unido al adsorbente pero que permanecen en el cartucho.

Elución Eluir el analito de interés. se añade un disolvente que anule las interacciones entre el adsorbente y el analito. El disolvente deberá tener la máxima interacción con el analito y una interacción mínima con algunos interferentes que podrían haber quedado atrapados en el adsorbente.

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Concentración Conseguir que el volumen de elución sea lo menor posible para garantizar la concentración del analito.

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Muestra: material objeto de análisis en el que se pretende determinar cualitativa, cuantitativa o estructuralmente uno o varios componentes (analitos). Analito: componente, o especie química, que se quiere determinar de una muestra. * Las muestra se analizan y los analitos se determinan. * Matriz: medio en el que se encuentra el analito. Es todo lo que contiene la muestra excluyendo el analito. A veces puede interferir en la determinación del analito. Interferencia: Error que se produce en la determinación del analito debido a la presencia de otros componentes en la muestra (interferentes). Selectividad: capacidad de un método para determinar analitos específicos con interferencias de otros componentes

Glosario

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Fase solida estacionaria: material que permanece dentro de la columna cromatográfica durante la cromatografía y que retiene algún componente de la muestra Adsorbente: sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en corrientes líquidas o gaseosas. Solvatar: proceso de formación de interacciones entre moléculas de un disolvente con moléculas o iones de un soluto. En la disolución los iones del soluto se dispersan y son rodeados por moléculas de solvente, lo mismo ocurre en las moléculas del solvente. Eluir: proceso de extraer un material de otro lavando con un solventer

Fuentes López, A., Fernández Segovia, I., & Fuentes López, C. (2020). Preparación de muestra mediante la técnica de Extracción en Fase Sólida. Disponible en: https://riunet.upv.es/handle/10251/145915

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Bibliografía

Peralta, A. (2011). REVISIÓN DEL ESTUDIO DE VOLÁTILES EN CAFÉ (Coffea arabica) POR MICROEXTRA CCIÓN EN FASE SÓLIDA. Alimentos Hoy, 19(19), 39-46.

Objetivos y resultadosProceso

HS-SPME, acoplado a GC/MS y PCA Técnica reproducible y efectiva Caracterización de cafés diferentes regiones y variedades Diferenciar muestras de C. arabica y C. robusta de 8 partes diferentes del mundo.

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Determinar compuestos volátiles característicos del aroma del café Compuestos impacto en el aroma de café

Determinar la calidad del café

Aroma en bebidas de café Cambios en la concentración de volátiles en bebidas de café.

Mayor concentración de pirazinas en muestras de C. arabica

ácidos, aldehídos, alcanos, alquenos, ésteres, furanos, cetonas, lactonas, oxasoles, fenoles, piridinas, pirazinas, pirroles y compuestos azufrados

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Compuestos de impacto en el aroma de café. Análisis de dilución del extracto del aroma (AEDA) y el cálculo de unidades de olor

2-furfuriltiol, 4-vinilguayacol, ciertas alquilpirazinas y furanonas, acetaldehído, propanal, 2-metilpropanal y 3- metilpropanal.

Fueron disueltos en una mezcla de aceite/agua y el perfil obtenido fue muy similar al de una muestra real de acuerdo a pruebas sensoriales con catadores.

Evaluación comparativa de los defectos del café tostado (inmaduro y sobremaduro, granos negros) y rancidez. Los granos rancios presentaron una mayor cantidad de compuestos que en granos sanos, seguido por los granos sobremaduros e inmaduros.

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Determinar la calidad del café

Café espreso aldehídos. Los componentes del aroma del café espresso no son los mismos que para el café tostado. Se establecieron correlaciones entre los componentes impacto y el flavor en el café espresso a partir de PCA separación y caracterización del aroma de 3 muestras de diferentes variedades botánicas.

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Aroma en bebidas de café

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Micro extracción en fase sólida en espacio de cabeza (HSSPME)

1. Extracción de los analitos desde la muestra mediante una fibra de cuarzo recubierta con fase estacionaria. se puede hacer en el espacio de cabeza (El analito se extrae del espacio que está encima de la muestra tras un calentamiento previo para volatilizar el analito) o por inmersión en la muestra.

2. Desorción de los mismos para el análisis, térmicamente en el inyector del GC.

(Headspace solidphase microextraction).

La efectividad en la extracción de los analitos depende de varios parámetros:

Optimización del método

Tipos de fibra “lo similar disuelve lo similar”. - La fibra apolar de polidimetilsiloxano (PDMS) extracción de sustancias apolares como lo son muchos compuestos volátiles del aroma. - La fibra de poliacrilato (PA) una de las más polares, es empleada para determinar fenoles y alcoholes. - Fibras que contienen como soporte carbón activado (CAR) o divilbenceno (DVD) incrementar la capacidad de retención - Fibras con fase estacionaria combinada (PDMS/DVB, CAR/DVB y CW/DVB) extracción de analitos polares y de bajo peso molecular.

La efectividad en la extracción de los analitos depende de varios parámetros:

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Volumen de muestra reducir el espacio de cabeza  maximizando el volumen de muestra contenido en el vial. Temperatura y tiempo de extracción optimo Tª presión de vapor de los analitos favorece su extracción. Tª constante de distribución no favorece la extracción. tiempo contacto de los analitos con la fibra. tiempo desorción no favorece la extracción.

La efectividad en la extracción de los analitos depende de varios parámetros:

pH del medio. cuando la matriz de análisis presenta compuestos ácidos y/o básicos. La extracción se realiza de manera efectiva si estos compuestos están mayoritariamente en su forma molecular. El estado iónico de los analitos influye en la eficiencia de la extracción. En general, las muestras son acidificadas para la extracción de analitos ácidos, y alcalinizadas para la extracción de los básicos. Derivatización: La conversión en sustancias derivadas permite su diferenciación del resto de los componentes de la matriz. Desorción de los analitos en la fibra: dependiente de la volatilidad de los analitos, espesor de la fibra, profundidad del inyector, temperatura del inyector y el tiempo de exposición. Tº de desorción optima ~ punto de ebullición del analito menos volátil. Tener en cuenta Tº de descomposición de la fase estacionaria de la fibra.

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La efectividad en la extracción de los analitos depende de varios parámetros:

Fibra PDMS: diferenciar C. arabica de C. robusta por PCA Fibra Carboxen/PDMS: mayor sensibilidad hacia moléculas más pequeñas Fibra PDMS/DVB: mejor sensibilidad. Fibra DVB/CAR/PDMS comparada contra PDMS/DVB: fue mejor para bebidas de café

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Optimización del método

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10 ng 1 mL 0,3 mL

3 ng

3 ng 10 mL 15 mL

4,5 ng en 2g muestra 0,0045 µg

0,0045 µg 2 g 1000 g

2,25 µg / Kg

Recuperación2,25 µg / Kg 70% 100%

3,21 µg / Kg

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Para la SPE se utiliza Cartucho de tipo MAX de 200 mg.
Adsorbentes en modo mixto de fase reversa e intercambio anicónico. Alta selectividad para compuestos ácidos.

Compatibles con una amplia variedad de solventes utilizados en cromatografía
Capacidad de carga de hasta 200 mg de muestra: adecuados para el preconcentración de muestras con niveles bajos de analitos.
Alta reproducibilidad: mayor confiabilidad y precisión
Resistentes y duraderos.

¿Cómo será su interacción con el analito?

¿Es selectivo?

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Se ajusta el pH antes de la SPE para modificar la carga del analito y aumentar su retención selectiva ya que el cartucho de tipo MAX es un absorbente que tiene alta selectividad para compuestos ácidos
Se eluye a pH 2 para desorber el analito de la fase estacionaria

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El hexano es un disolvente orgánico utilizado para la extracción liquido-liquido

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Se produce una preconcentración en la SPE ya que se carga con 10mL y se eluye 4 mL.
Después de la SPE se produce otra preconcentracion ya el extracto purificado se lleva a sequedad y luego se reconstituye en 300 µL de fase móvil

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El OPA se añade como reactivo para derivatizar los grupos amino presentes en el analito, facilitando su detección por el detector de fluorescencia. Permite mejorar la sensibilidad y selectividad del método analítico

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Se emplea un detector de fluorescencia. Si es adecuado para este tipo de analitos, ya que muchos antibióticos tienen propiedades fluorescentes.
Otro detector que podría emplearse es un detector UV-visible, pero el detector de fluorescencia suele ser más sensible y selectivo para este tipo de compuestos.

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La separación del analito se lleva a cabo en fase normal.
El modo cromatógrafo empleado es el adecuado ya que se consigue una buena separación y anchura del pico, lo que permite su cuantificación

Determinación de teobromina y cafeína en muestras de cacao

La determinación del contenido de cacao es importante en los productos a base de cacao; para ello, la proporción de teobromina (Sustancia estrechamente relacionada con la cafeína) y cafeína en el cacao y los productos del cacao se puede utilizar como criterio para calcular el contenido de cacao. Para la determinación de teobromina y cafeína en muestras de cacao se sigue el siguiente procedimiento: 5 g de cacao en polvo se someten a una extracción en un extractor Soxhlet hasta quedar libre de grasa. Este se lleva a la estufa para eliminar los restos de éter que hayan podido quedar. Se cogen 0,5g del cacao en polvo desgrasado y se disuelven con agua hasta un volumen final de 50mL. Este extracto se lleva a una extracción en fase solida (SPE), para ello se utiliza un cartucho Sep-pak C18. Se acondiciona con 2 mL de metanol. Con una jeringa vacía se hace pasar aire a través del cartucho para expulsar el metanol restante. Se carga el cartucho con 1mL de extracto de cacao, se rechaza el eluido. El lavado se realiza con 5 mL de agua, con una jeringa vacía se hace pasar aire a través del cartucho para expulsar el agua restante. La elución de la teobromina y la cafeína se realiza con 10 mL de cloroformo. El eluido se recoge en un matraz de evaporización. El cloroformo se elimina en un baño de agua al vacío. El residuo del matraz se disuelve en agua hasta completar 4mL. Se inyecta una alícuota de 7uL en la columna de HPLC con las siguientes condiciones: fase inversa C18; fase móvil mezcla agua/acetonitrilo (80:20 v/v) de modo isocrático; detector UV-Visible; longitud de onda 276 nm.

ventajas e inconvenientes

5 g Cacao en polvo Extractor Soxhlet eliminar grasa (interferente). Estufa eliminar el eter utilizado en la extraccion Cacao desgrasado 0,5g cacao desgrasadodisolución Vf=50 mLAlicuota de 1 mL

Acondicionamiento: 2 mL metanol
Carga de la muestra: 1 mL extracto de cacao
Lavado: 5 mL agua
Elución: 10 mL cloroformo

SPE

Cartucho Sep-pak C18

matraz de evaporización

Eluido Baño de agua al vacío eliminar el cloroformo

CromatografíaAlicuota 7uLExtracto purificado reconstituido con 4 mL agua Extracto purificado

Cartucho Sep-pak C18: Descripción del producto: Los cartuchos Sep-Pak C18 Vac contienen una fase enlazada hidrofóbica de base de sílice de fase reversa que se utiliza para adsorber analitos de hidrofobicidad incluso débil de las soluciones acuosas. El sorbente Sep-Pak C18 se fabrica mediante la tecnología de enlazado más reproducible disponible, utilizando la química de silano monofuncional. Este sorbente ofrece una selectividad única y una excelente recuperación de analitos, y se recomienda como fase SPE de uso general para analitos polares y no polares. Estos cartuchos en forma de cilindro de jeringa se diseñan para utilizar con colectores de vacío e instrumentos de SPE automatizados.

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https://www.waters.com/nextgen/es/es/shop/sample-preparation--filtration/wat023590-sep-pak-c18-1-cc-vac-cartridge-100-mg-sorbent-per-cartridge-55--.htmlhttps://www.waters.com/webassets/cms/support/docs/wat011188.pdf

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Inconvenientes a tener en cuenta durante el proceso

Concentraciones demasiado altas en cromatografía diluir

Ventajas de la SPE en el proceso

Se usa HPLC para su determinación por su eficiencia, sensibilidad y especificidad  SPE hace más eficaz
SPE extrae selectivamente el analito de interés, desechando los compuestos que pueden producir interferencias en el análisis.
Se consigue una concentración del analito, con lo que se consigue disminuir los tiempos de trabajo y la cantidad de solventes

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Fase inversa C18
Fase móvil mezcla agua/acetonitrilo (80:20 v/v) de modo isocrático
Detector UV-VisibleLongitud de onda 276 nm.

Condiciones cromatografica

Sanabria, L. M., Martínez, J. A., & Baena, Y. (2017). Validación de una metodología analítica por HPLC-DAD para la cuantificación de cafeína en un ensayo de permeación in vitro empleando mucosa oral porcina. Revista Colombiana de Ciencias Químico-Farmacéuticas, 46(2), 202-219.

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