TD : la réplication de l'ADN

Objectif : découvrir comment se fait la réplication (phase S), c’est-à-dire la fabrication de la 2ème chromatide grâce à un TD « dont vous êtes le héros ».

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Schématisez les différentes hypothèses, en utilisant le bleu pour les chaines de nucléotides initiales et le rouge pour les chaines de nucléotides nouvellement créées.

Etape 1 : les hypothèses

Tu as trouvé 1 hypothèse ?

Tu as trouvé 2 hypothèses?

Tu as trouvé 3 hypothèses?

Tu as trouvé 1 hypothèse ?

Tu as trouvé 2 hypothèses?

Tu as trouvé 3 hypothèses?

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Sachant que les termes de "conservative", "semi-conservative" et "dispersive" font référence à la molécule d’ADN initiale, complétez vos schémas de l’étape 1.

Les trois modèles hypothétiques de réplication s’appellent : - réplication conservative - réplication semi-conservative - réplication dispersive

Etape 2 : le nom des 3 hypothèses

Etape 8 : Aïe, votre interprétation des résultats est erronée…

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Etape 9 : Aïe, votre interprétation des résultats est erronée…

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Pour trouver quelle hypothèse était la bonne, James Taylor puis Meselson et Stahl cultivent des bactéries E. Coli dont l'avantage est de présenter des cycles cellulaires rapides (moins de 30 min) et synchronisés. Ces bactéries sont cultivées sur un milieu normal*. Après extraction de leur ADN, on pratique une centrifugation de ces molécules, dite en gradient de densité**. On agit de même avec des bactéries cultivées sur un milieu dont l'azote normal 14N est remplacé par l'isotope 15N de l'azote, dit azote lourd.

Etape 3 : expérimenter pour trancher entre les différentes hypothèses.

Résultats témoins obtenus :

Représenter les résultats attendus pour chacune des hypothèses à l’issue de ce 1er cycle cellulaire. Vous choisirez 2 couleurs différentes : - le bleu pour les chaines de nucléotides riches en 15N - le rouge autre pour les chaines de nucléotides riches en 14N

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Expérience : Des bactéries E. coli sont cultivées dans un milieu ne contenant que de l’azote 15N pendant 14 cycles cellulaires. On considère alors que leur ADN ne contient que de l’azote 15N. On les remet ensuite en culture dans un milieu ne contenant que de l’azote 14N.

Encore un peu d'aide ?

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Besoin d'aide? Représenter les tubes qui devraient être obtenus après centrifugation. Préciser les proportions de chaque « type » d’ADN : - ADN ne contenant que de l’azote 15N, s’il y en a - ADN ne contenant que de l’azote 14N, s’il y en a - ADN contenant à la fois de l’azote 14N et de l’azote 15N, s’il y en a

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Représenter, pour chacune des 2 hypothèses restantes, les molécules d’ADN obtenues, ainsi que les résultats de l’ultra-centrifugation, après ce cycle supplémentaire.Avec le même code couleur : bleu avec nucléotides 15N, rouge avec nucléotides 14N.

Expérience suivante : Les bactéries E. coli sont maintenues pendant une génération supplémentaire dans un milieu contenant de l’azote 14N.

Étape 7 : Bonne interprétation ! Mais il reste encore 2 hypothèses…

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Etape 4 : Représenter les résultats attendus

Comparez ce résultat avec les résultats attendus. Une des hypothèses est réfutée. Précisez laquelle, en justifiant votre réponse.

Etape 5 : Résultats obtenus

l’hypothèse conservative est réfutée l’hypothèse semi-conservative est réfutée l’hypothèse dispersive est réfutée Je ne vois pas comment faire

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Clique pour t'aider à donner la densité de chacune des molécules d’ADN obtenue selon l'hypothèse? Prêt pour comparer aux résultats obtenus ?

Etape 6 : Besoin d'aide?

Reprenez les schémas de l’étape 1 :

Comparez ce résultat avec les résultats attendus. Une des hypothèses est réfutée. Précisez laquelle, en justifiant votre réponse.

Etape 5 : Résultats obtenus

l’hypothèse conservative est réfutée l’hypothèse semi-conservative est réfutée l’hypothèse dispersive est réfutée

Quelle hypothèse est donc verfiée ?

Etape 10 : Résultats obtenus à la deuxième génération

Résultat de l’ultracentrifugation après 2 générations en milieu 14N :

La réplication est dispersive !

La réplication est semi-conservative !

BRAVO !

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* L'azote est un constituant majeur de l'ADN. L'azote14 (14N) en est, de loin, l'isotope le plus répandu sur Terre, contrairement à l'azote 15 (15N) considéré comme lourd. Ce dernier n'est pas radioactif, juste plus lourd que l'isotope commun, car il contient un neutron supplémentaire.

** Gradient de densité : on prépare des tubes dont la densité varie en fonction de la position dans le tube. Lorsque de l'ADN est extrait des cellules puis centrifugé sur un gradient salin de densité, l'ADN migre jusqu'au point où sa densité est égale à celle de la solution saline.

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