SMA-SLU

"Los seres humanos realizamos una amplia gama de movimientos sin ser plenamente conscientes de cómo los ejecutamos. Sin embargo, para 1 de cada 40 personas de la población, es todo un milagro"

INTRODUCCIÓN

SMA, ESTUDIO DE SUS MECANISMOS PATOGÉNICOS Y DE SU TRATAMIENTO CON Nusinersen (Spinraza®)

Proyecto de investigación

Autor: Isaac Salto Aguado

05/2023

Tutora: E.Barragan/N.Sancho/O.Tarabal

Hipótesis

Introducción

Motivación y contexto

Planteamiento

Materiales y métodos

Objetivos

índice

Resultados

La motoneurona

SMA

Conclusiones

Agradecimientos

S. Terapéutica

MOTIVACIÓN Y contextO

Motivación y contexto

La ocasión para...

Investigación biomédica (TG) Grupo de neuropatologia experimental (IRBLleida) Atrofia muscular espinal (SMA) :

• Ácidos nucléicos / Biologia molecular
• Procesos y técnicas científicas
• Eficacia y comportamiento (SMA, Nusinersen y MNs)

+ Introducción

MOTIVACIÓN Y CONTEXTO

OBJETIVOS

Generales

Específicos

Se concentran en:

• Gama de trastornos neuromusculares (SMA)

I. Estudio de las bases celulares y biomoleculares

Profundizar mis conocimientos

De la patologia

Participar

Desarollo de un proyecto científico

II. Desarrollo

• De la estrategia terapéutica propuesta

Demostrar empíricamente

Mecanismos patogénicos de la enfermedad

Verificar la eficacia

Nusinersen SPINRAZA

Objetivos

marco teórico

Las Motoneuronas (MNs)

Localización

Tipo de céulula

Neurotransmisor

MN visceral especialNM visceral general MN somática

Objetivo

Síntomas por lesión

• MNs-α

+ Bases neuronales

MARCO TEÓRICO

Atrofia muscular espinal (SMA)

Descripción general

• Guido Werdnig.

• Grupo de patologias autosómicas y recesivas principalemente caracterizadas por la degeneración progresiva de las α-MNs

Genéticamente

• Brazo largo del cromosoma 5 (5q13.2) : SMN1 et SMN2.
• Deleción homocigota o la mutación del gen
• Febleza miembros inferiores y distales.
• Disfunción de la musculatura intercostal > complicaciones respiratorias
• Cognición no se ve nunca afectada

MARCO TEÓRICO

Atrofia muscular espinal (SMA)

Descripción general

• Guido Werdnig.

• Grupo de patologias autosómicas y recesivas principalemente caracterizadas por la degeneración progressiva de las α-MNs

Genéticamente

• Brazo largo del cromosoma 5 (5q13.2) : SMN1 et SMN2.
• Deleción homocigota o la mutación del gen
• Febleza miembros inferiores y distales.
• Disfunción de la musculatura intercostal > complicaciones respiratorias
• Cognición no se ve nunca afectada

MARCO TEÓRICO

La estrategia terapéutica

• FDA, Diciembre 2016.
• Solución inyectable de 12 mg / 5 ml
• ASO
• Precisamente, Nusinersen actúa en el ESS del exón 7 del pre-ARNm del gen SMN2 > producción completa de SMN

• Cadenas cortas de nucleótidos
• ARNm específicos
• Complementariado de bases

+ ST no específicas

maco teórico

marco práctico

« Tal vez la estrategia terapéutica Nusinersen SPINRAZA es eficaz lpara el tratamiento de la neuropatologia de la atrofia muscular espinal »

Hipótesis

Planteamiento

• Manutención de la colonia (WT, KO, tratados)
• Extracción de ADN /genotipaje /niveles proteicos de SMN
• Inyección del fármaco por via intracerebroventricular.
• Sacrificio y muestras.
• Técnica de immunohistoquímica / microscopia bifocal
• Determinar la efectividad de Nusinersen SPINRAZA.

FVB.Cg-Grm7Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1Msd Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb/J

Tests de capacidad motora

Tube Test (TT)

Righting Reflex (RR)

• Posición prono
• Tubo de centrífuga de 50 ml de capacidad,
• 3 repeticiones
• 2 parámetros: Tiempo TT/Calificación TT

• Posición supina (no natural)
• Tiempo máximo de 30 segundos
• 3 repeticiones
• Éxito> 4 extremidades listas para andar

marco práctico

Genotipaje (PCR)

Base

• Presencia o absencia de transgenes
• Identificar nucleótidos o bases específicos
• Marcaje > genotipaje
• REDExtract-N-Amp de Sigma-Aldrich (St. Louis, États-Unis)

Or...

• 3 primers fueron necesarios
• WT, una franja de 800 pares de bases (pb) ,
• KO 500 pb et en los heterocigotos, les dos franjas eran visibles.

marco práctico

Disección del ratón

ME et TA

Perfusión, disección y extirpación

marco práctico

Immunohistoquímica

• Proceso con la incubación de 2 anticuerpos
• 2a con fluorocromo
• Bloqueador NHS
• Lavados y humectación

Lista de anticuerpos

CGRP 488 (rojo) MMP9 Cy3 (verde) HA Cy5 (rojo lejano) Nissl bleu (azul)

+Annexo I

marco práctico

Western Blot (WB)

• A partir de tejidos obtenidos como resultado de una disección.
• Detección de proteínas por electroforesis en gel (tamaño)
• Transferidas a una membrana absorbente,
• Con anticuerpos específicos de la proteína problema.
• Métodos de quimioluminiscencia.

Resultados y discusión

CHAPITRE I

Fenotipo, supervivencia y alteraciones de la capacidad motors de los modelos de sma

CHAPITRE II

GENÉTICA DE LA ENFERMEDAD Y CAMBIOS EN LOS NIVELOS EXPRESOS DE PROTEÏNA SMN

CHAPITRE III

ALTERACIONES ULTRASTUCTURALES EN EL SISTEMA NEUROMUSCULAR: AFECTACIONES EN LA MÉDULA

CHAPITRE IV

ALTERACIONES ULTRASTUCTURALES EN EL SISTEMA NEUROMUSCULAR: EFECTOS EN LAS NMJs

Résultats et discussion

resultados y discusión

resultados y discusión

Berciano, M.T, et al., 2020

resultados y discusión

conclusiones

CONCLUSIONES

Hipótesis corroborada

Dismunución MNs-α

Reducción Pt SMN

NMJ

Nusinersen > eficaz

KO et WT = tratados

Tejido nervioso > égale

Área, porcentaje e intensidad> cambios morfológicos

CONCLUSIONeS

AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos

Invdra. Alaó Gatius Puchercós

Dr. Olga Tarabal Mostazo

AGRADECIMIENTOS

¡Muchasgracias!

Turno de preguntas