Klonierung

Seminar: Methoden der Molekularbiologie für Lehramtsstudierende (SoSe 22) Dozentinnen: Dr. Maren Wichmann, Hendrika van Waveren, Prof. Jutta Papenbrock Referenten: Ananias Schumacher, Marvin Wente, Milan Wülfing

Teil 1 - Plasmidisolation und Medienherstellung

Klonierung

Den "Koffer" als solches gibt es heutzutage nicht mehr. Stattdessen stehen Anleitungen mit den Einzelkomponenten zum Bestellen zur Verfügung.

Alle dafür notwendigen Utensilien befinden sich im „Blue Genes“ -Koffer. In diesem Versuch wird das Experiment des „Blue Genes“-Koffers nachgearbeitet.

Der „Blue Genes“-Koffer (BG-Koffer) war ein Experimentierkasten, der von der Firma Roche für den Einsatz im Schulunterricht konzipiert wurde und mittlerweile in abgewandelter Form von Promega angeboten wird. Er ermöglicht sowohl die Analyse von DNA als auch eine einfache Klonierung. Hierbei wird ein Restriktionsverdau, eine Ligation, eine Transformation und eine Selektion durchgeführt.

Gentechnik in der Schule

„Blue Genes“-Koffer

Einführung

1. Medium vorbereiten

4. Kerncurriculum

Einführung

5. Ergebnisse

2. Plasmide

3. Plasmidisolation

Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

Einheiten

Für die Anzucht von Bakterien findet im Labor häufig das sogenannte LB-Medium Anwendung. Dies kann sowohl in flüssiger Form für die Anzucht von Flüssigkulturen verwendet werden, als auch durch Zugabe von Agar-Agar als Festmedium für das Ausplattieren und die Anzucht von Bakterienkolonien.

1. Medium vorbereiten

Methode

Medium vorbereiten

• 8 g LB-Mischung in ca. 100 ml H2O (Wasser vorlegen, Substanzen dann zugeben) vollständig lösen
• Auffüllen auf ca. 350 ml mit H2O
• Einstellen des pH-Werts auf 7.0 mit 1 M NaOH (Schutzbrille und Handschuhe!)
• Volumen auf 400 ml mit H2O auffüllen
• Autoklavieren

Festmedien werden wie oben beschrieben hergestellt und 1.5 % Agar direkt vor dem Autoklavieren in die Flasche mit dem fertigen Medium zugefügt. Wichtig: Soll das Festmedium im Anschluss an den Autoklaviervorgang direkt ausgegossen werden, sollte der Rührfisch in der Flasche verbleiben!

Herstellung LB-Medium (1 L):

Methode

Medium vorbereiten

Agarplaten gießen

• Nach dem Autoklavieren Medien abkühlen lassen, bis die Flaschen „anfassbar“ sind. Achtung: Agar darf nicht fest werden!
• Vor dem Gießen sterile Zugabe der entsprechenden Zusätze, und erneut aufrühren, damit der Agar und die Zusätze gleichmäßig im Medium verteilt vorliegt
• Gießen von ca. 25 ml Medium pro kleiner Agarplatte (9 cm ∅) und abkühlen lassen.
• Platten bei 4 °C lagern.

Was ist besonders wichtig zu beachten bei der Einstellung des pH-Werts eines LB-Mediums?

Schutzbrille und Handschuhe tragen

Der pH-Wert muss sich im sauren Bereich befinden

Nicht mehr als 1 M NaCl verwenden

Pro Substanz etwas Wasser zugeben, dann vollständig auffüllen

Substanzen vorlegen, Wasser dann zugeben

Wasser vorlegen, Substanzen dann zugeben

Bei der Herstellung des LB-Mediums ist welche Vorgehensweise richtig?

Der Rührfisch muss in der Flasche bleiben.

Der Rührfisch muss zuvor entnommen werden.

Es wird kein Rührfisch bei der Herstellung von Festmedien verwendet.

Was ist beim Autoklavieren zu beachten, wenn das Festmedium direkt im Anschluss ausgegossen werden soll ?

2. Plasmide

fertig!

4. Kerncurriculum

Einführung

5. Ergebnisse

1. Medium vorbereiten

3. Plasmidisolation

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

Einheiten

Passwort eingeben

Ordnet die historischen Meilensteine der Insulinforschung in chronologischer Reihenfolge um das Schlüsselwort zu erhalten. Klickt auf das Auge, für die Auflösung.

Gentechnischen Verfahrens zur Insulinherstellung mittels E. coli-Bakterien wird entwickelt (E)

Insulin aus Bauchspeicheldrüsen wird diabetischem Hund injiziert (N)

Leonard Thompson wird als erster Mensch erfolgreich behandelt (S)

Humaninsulin kommt auf den Markt (L)

Entdeckung von insulinproduzierenden Zellen (I)

WEITER

Passwort eingeben!

Alltagsvorstellungen, interaktive Arbeitsbläter und theoretische Einheit zu Plasmiden

2. Plasmide

Didaktik

Plasmide

Bevor wir beginnen, möchten wir zunächst wissen welche Vorstellungen ihr zu dem heutigen Thema habt. Dazu klickt ihr bitte links auf das Bild und beantwortet stichpunktartig folgende Fragen im Mentimeter. Welche besonderen Eigenschaften zeichnen Plasmide aus? Warum könnten Plasmide bei der Herstellung von Insulin nützlich sein?

Alltagsvorstellungen

Beschriftet die schematische Skizze der Bakterienzelle. Wenn ihr auf die einzelnen Organellen bzw. Kompartimente klickt, öffnet sich ein Fenster in der die Funktion beschrieben wird. Klickt auf das Auge für die korrekte Lösung!

Plasmamembran

Ribosom

Cytoplasma

Nukleoid

Plasmid

Zellwand

Zelleinschlüsse

Kapsel

Pili

Flagellum (Geißel)

Didaktik

Plasmide

Plasmamembran

Ribosom

Cytoplasma

Nucleoid

Plasmid

Zellwand

Zelleinschlüsse

Kapsel

Pili

Flagellum (Geißel)

Didaktik

Plasmide

Didaktik

Plasmide

Welche Vorteile für den Unterricht bieten Interaktive Arbeitsblätter? Was spricht gegen den Einsatz interaktiver Arbeitsblätter? Welche Differenzierungsstrategien werden im vorliegenden Arbeitsblatt angewendet?

Interaktive Arbeitsblätter im Biologieunterricht

Plasmide in verschiedenen Konformationen im elektronenmikroskopischen Bild.

Theorie

Plasmide

• kleine, in der Regel ringförmige, eigenständig replizierende DNA-Moleküle
• häufig in Prokaryoten zu finden, liegen extrachromosomal vor
• Isolation von Plasmiden ist eine der häufigsten Aufgaben des Molekularbiologen
• können sich selbstständig vermehren
• sind austausch- und übertragbar

Was sind Plasmide?

Biologie der plasmide

Frage 1/3

Falsch

Wahr

Plasmide werden unabhängig vom Chromosom repliziert.

BIOLOGIe DER PLASMIDE

Weiter

Wahr

Plasmide können sich selbstständig vermehren und zählen nicht zum Bakterienchromosom.

Frage 1/3

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Plasmide liegen ausschließlich in zirkulärer Form vor.

Frage 2/3

Falsch

Wahr

Falsch

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Weiter

Falsch! Es gibt auch einige wenige Prokaryoten die lineare Plasmide beinhalten.

Frage 2/3

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Frage 3/3

Falsch

Wahr

Plasmide enthalten u.a. Resistenzgene gegen Antibiotika.

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Weiter

Wahr

Richtig! Plasmide kodieren z. B. Enzyme, die in der Lage sind, Antibiotika zu spalten und sie dadurch unwirksam zu machen.

Frage 3/3

fertig!

fertig!

fertig!

3. Plasmidisolation

4. Kerncurriculum

Einführung

5. Ergebnisse

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

Einheiten

Plasmid mit Ethanol waschen (ON)

RNA abbauen (R)

Zellteile abzentrifugieren (Plasmide bleiben im Überstand gelöst) (K)

Plasmide mit Isopropanol ausfällen (I)

Ordnet die einzelnen Schritte der Plasmidisolation in die richtige Reihenfolge

Gelöste Plasmide in neues Reaktionsgefäß überführen (T)

Chromosomale DNA denaturieren und abzentrifugieren (I)

Bakterienzellen abzentrifugieren (RE)

Zellen resuspendieren und aufschließen (ST)

WEITER

Passwort eingeben

- Überstand mit Plasmiden in neues Gefäß überführt

- Bakterienteile abzentrifugiert - Plasmide noch gelöst

- Zellen aufgeschlossen - DNA denaturiert - RNA abgebaut

Abzentrifugiertes Bakterienpellet

Praxis

Plasmidisolation

• 2 ml der Bakterienkultur werden 2 min zentrifugiert (Zentrifuge austarieren!)
• den Überstand in den Abfallbeutel pipettieren
• 200 µl Lsg. 1 sowie 2 µl RNase zugeben und das Pellet durch kräftiges Anschnipsen resuspendieren
• 200 µl Lsg. 2 zugeben, 3x invertieren
• 200 µl Lsg. 3 zugeben, 3x invertieren
• 1 min auf Eis inkubieren
• für 2 min zentrifugieren (Zentrifuge austarieren!)
• den klaren Überstand mit einer Pipette abnehmen und in neues Reaktionsgefäß überführen
• den überführten Überstand erneut für 2 min zentrifugieren den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführen (nur klare Flüssigkeit pipettieren)

Durchführung - Teil 1

- Plasmidpellet mit Ethanol zentrifugieren - Restethanol entfernen und trocknen

- Plasmidpellet am Boden- Überstand entfernen

Gelöste Plasmide mit Isopropanolmischen

• Zugabe von 600 µl Isopropanol zum Überstand, gut mischen
• 5 min auf Eis inkubieren
• für 2 min zentrifugierenden Überstand in den Abfallbeutel pipettieren
• 1 ml 70 % Ethanol auf das Pellet pipettieren, Pellet nicht resuspendieren
• für 1 min zentrifugieren
• Ethanol sehr sorgfältig mit der Pipette abnehmen ohne das Pellet zu zerstören
• Pellet bei Raumtemperatur trocknen (Reaktionsgefäß offen stehen lassen)
• DNA in 30 µl H2O aufnehmen

Praxis

Plasmidisolation

Durchführung - Teil 2

fertig!

fertig!

fertig!

fertig!

3. Plasmidisolation

4. Kerncurriculum

Einführung

5. Ergebnisse

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

Einheiten

Download

Schritt 2, wenn ihr die Aufgabesoweit abgeschlossen habt.

Aufgabe: Ladet euch das KC herunter und verschafft euch einen groben Überblick über die neue Aufteilung der Kompetenzen sowie die gestalterische Darstellung in den Tabellen. Versucht anschließend die Schwerpunkte der heutigen Einheit im KC begründet einzuordnen.

• neues KC seit 2022
• relevant für uns im Referendariat
• neue Strukturierung
• Eine Tabelle für jeden Themenschwerpunkt mit Kompetenzen in direkter Übersicht

Didaktik

Kerncurriculum

Das neue KC 2022

• Im neuen KC der Sek II kaum molekularbiologische Methoden vertreten.
• Lediglich PCR und Gelelektrophorese werden erwähnt.
• Dafür aber: 2.3 Fachkompetenz in der digital basierten Welt
• Interaktives Arbeitsblatt
• Lernvideos

"Der Biologieunterricht der gymnasialen Oberstufe hat primär den Aufbau und die Förderung von Fachkompetenz zum Ziel. In einer digitalen Welt ist es erforderlich, dass sich diese Fachkompetenz auf digitalen Anwendungs- und Handlungsfeldern realisieren lässt. Dies gilt gleichermaßen für die private, gesellschaftliche und berufliche Teilhabe in Gegenwart und Zukunft. Daher gehört digital basiertes Leh- ren und Lernen zum festen Bestandteil von Biologieunterricht. [...] Eine digitalisierte Welt erweitert nicht nur die medialen Möglichkeiten des Lehrens und Lernens, sie hat überdies grundlegende Auswirkungen auf die Biologie als Wissenschaft und somit als Unterrichtsfach. Bei der Erstellung und kontinuierlichen Anpassung des schuleigenen Arbeitsplans ist daher fortwährend zu prüfen, inwieweit digitale Lehr- und Lernangebote den Erwerb von Fachkompetenz fördern können, beziehungsweise inwiefern durch Digitalisierung veränderte Aspekte der Biologie als bildungsrelevant erachtet werden."

Didaktik

Kerncurriculum

Das neue KC 2022

Aufgabe: Erarbeitet aus den Kompetenzbereichen einen Block für das KC unter dem Basiskonzept "Information und Kommunikation". Entscheidet euch dabei für passende Kompetenzen sowohl für den Bereich Sachkompetenz als auch für die prozessbezogenen Kompetenzen (Erkenntnisgewinnung, Kommunikation, Bewertung)

Download

Didaktik

Kerncurriculum

Einbindung von Klonierung in das KC

fertig!

fertig!

fertig!

fertig!

fertig!

3. Plasmidisolation

5. Ergebnisse

4. Kerncurriculum

Einführung

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

Einheiten

Methode

Medium vorbereiten

Agarplaten gießen

• Nach dem Autoklavieren Medien abkühlen lassen, bis die Flaschen „anfassbar“ sind. Achtung: Agar darf nicht fest werden!
• Vor dem Gießen sterile Zugabe der entsprechenden Zusätze, und erneut aufrühren, damit der Agar und die Zusätze gleichmäßig im Medium verteilt vorliegt
• Gießen von ca. 25 ml Medium pro kleiner Agarplatte (9 cm ∅) und abkühlen lassen.
• Platten bei 4 °C lagern.

Ergebnisse

Ihr habt heute schon ein wenig über Plasmide und ihren Nutzen für die Insulinherstellung gelernt.Nun wollen wir uns angucken, wie ihr zu Beginn der Einheit darüber gedacht habt...

Ergebnisse

Nächste Woche geht es weiter mit... Ligation und Transformation

fertig!

fertig!

fertig!

fertig!

fertig!

fertig!

3. Plasmidisolation

4. Kerncurriculum

Einführung

5. Ergebnisse

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Alles erfolgreich abgeschlossen! Hervorragend!

Einheiten

Quellenverzeichnis

Campbell, N. A. & Reece, J. B. (aktualisierte Auflage), Biologie, Pearson, München Munk, K. & Dersch, P. (2018). Mikrobiologie. Georg Thieme Verlag. Niedersächsisches Kultusministerium, Kerncurriculum für das Gymnasium – gymnasiale Oberstufe Biologie, 2017 Niedersächsisches Kultusministerium, Kerncurriculum für das Gymnasium – gymnasiale Oberstufe Biologie, 2022 https://www.diabetesde.org/100-jahre-insulin-geschichte-lebenswichtigen-hormons [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://www.mediqdirekt.de/blog/insulin-eine-fast-hundertjaehrige-erfolgsstory [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://flexikon.doccheck.com/de/Resistenzplasmid [zuletzt aufgerufen am 21.05.2022] https://www.onmeda.de/krankheiten/krankheitserreger/bakterien/bakterien-aufbau-id200903/ [zuletzt aufgerufen am 23.05.2022] Bildquellen: https://www.merckmillipore.com/waroot/xl/110283_LB-Agar%20E.coli%20ATCC%2011775%5B110283_LB-Agar%20E.coli%20ATCC%2011775-ALL%5D.jpg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fb/LBmedium.JPG [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://gesundheitslexikon.uniklinikum-dresden.de/bilder/inselzellen-1.jpeg/@@images/151cca59-1a90-41c9-9cca-24a477dc5abd.jpeg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://images-cdn.9gag.com/photo/a8EdOZp_700b.jpg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://tu-dresden.de/ing/maschinenwesen/int/ressourcen/bilder/bioverfahrenstechnik/mikrobiologisches-praktikum-1/Platten_giessen.jpg/@@images/98831563-88aa-401c-92b1-6f6c559a5558.jpeg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://www.tagesspiegel.de/images/imago62748146h/11393786/2-format6001.jpg [zuletzt aufgerufen am 21.05.2022] https://images.saasworthy.com/mentimeter_870_logo_1600681783_e5oqu.png [zuletzt aufgerufen am 20.05.2022] https://i.ytimg.com/vi/5p7yUKJF9kQ/maxresdefault.jpg [zuletzt aufgerufen am 20.05.2022] https://www.industriepark-hoechst.com/media/standortportal/menue/der-iph/historie/d-ue-historie_eb-13-20-insulinplakat_1387_content4.jpg [zuletzt aufgerufen am 20.05.2022] https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ad/Plasmid_em.jpg [zuletzt aufgerufen am 23.05.2022] https://www.aok.de/kp/fileadmin/upload/AOK-BW/Curaplan/Wissen/Curaplan_aktiv_III_Artikel_Curaplan_Wissen_10_Antibiotika_800x500.jpg [zuletzt aufgerufen am 22.05.2022] https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/ad/Plasmid_em.jpg/400px-Plasmid_em.jpg [zuletzt aufgerufen am 24.05.2022] https://studyflix.de/biologie/plasmid-2128 [zuletzt aufgerufen am 24.05.2022] https://www.mentimeter.com/app/presentation/e6dbc23c49c962bb5a85fe19d6f580ed/6e35c51253b5 [zuletzt aufgerufen am 24.05.2022]