Klonierung

Klonierung

Teil 1 - Plasmidisolation und Medienherstellung

Seminar: Methoden der Molekularbiologie für Lehramtsstudierende (SoSe 22) Dozentinnen: Dr. Maren Wichmann, Hendrika van Waveren, Prof. Jutta Papenbrock Referenten: Ananias Schumacher, Marvin Wente, Milan Wülfing

Einführung

„Blue Genes“-Koffer

Gentechnik in der Schule

Alle dafür notwendigen Utensilien befinden sich im „Blue Genes“ -Koffer. In diesem Versuch wird das Experiment des „Blue Genes“-Koffers nachgearbeitet.

Der „Blue Genes“-Koffer (BG-Koffer) war ein Experimentierkasten, der von der Firma Roche für den Einsatz im Schulunterricht konzipiert wurde und mittlerweile in abgewandelter Form von Promega angeboten wird. Er ermöglicht sowohl die Analyse von DNA als auch eine einfache Klonierung. Hierbei wird ein Restriktionsverdau, eine Ligation, eine Transformation und eine Selektion durchgeführt.

Den "Koffer" als solches gibt es heutzutage nicht mehr. Stattdessen stehen Anleitungen mit den Einzelkomponenten zum Bestellen zur Verfügung.

Einheiten

Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

2. Plasmide

Einführung

1. Medium vorbereiten

5. Ergebnisse

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

1. Medium vorbereiten

Für die Anzucht von Bakterien findet im Labor häufig das sogenannte LB-Medium Anwendung. Dies kann sowohl in flüssiger Form für die Anzucht von Flüssigkulturen verwendet werden, als auch durch Zugabe von Agar-Agar als Festmedium für das Ausplattieren und die Anzucht von Bakterienkolonien.

Medium vorbereiten

Methode

Herstellung LB-Medium (1 L):

• 8 g LB-Mischung in ca. 100 ml H2O (Wasser vorlegen, Substanzen dann zugeben) vollständig lösen
• Auffüllen auf ca. 350 ml mit H2O
• Einstellen des pH-Werts auf 7.0 mit 1 M NaOH (Schutzbrille und Handschuhe!)
• Volumen auf 400 ml mit H2O auffüllen
• Autoklavieren

Festmedien werden wie oben beschrieben hergestellt und 1.5 % Agar direkt vor dem Autoklavieren in die Flasche mit dem fertigen Medium zugefügt. Wichtig: Soll das Festmedium im Anschluss an den Autoklaviervorgang direkt ausgegossen werden, sollte der Rührfisch in der Flasche verbleiben!

Medium vorbereiten

Methode

Agarplaten gießen

• Nach dem Autoklavieren Medien abkühlen lassen, bis die Flaschen „anfassbar“ sind. Achtung: Agar darf nicht fest werden!
• Vor dem Gießen sterile Zugabe der entsprechenden Zusätze, und erneut aufrühren, damit der Agar und die Zusätze gleichmäßig im Medium verteilt vorliegt
• Gießen von ca. 25 ml Medium pro kleiner Agarplatte (9 cm ∅) und abkühlen lassen.
• Platten bei 4 °C lagern.

Was ist besonders wichtig zu beachten bei der Einstellung des pH-Werts eines LB-Mediums?

Der pH-Wert muss sich im sauren Bereich befinden

Schutzbrille und Handschuhe tragen

Nicht mehr als 1 M NaCl verwenden

Bei der Herstellung des LB-Mediums ist welche Vorgehensweise richtig?

Substanzen vorlegen, Wasser dann zugeben

Pro Substanz etwas Wasser zugeben, dann vollständig auffüllen

Wasser vorlegen, Substanzen dann zugeben

Was ist beim Autoklavieren zu beachten, wenn das Festmedium direkt im Anschluss ausgegossen werden soll ?

Es wird kein Rührfisch bei der Herstellung von Festmedien verwendet.

Der Rührfisch muss zuvor entnommen werden.

Der Rührfisch muss in der Flasche bleiben.

Einheiten

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

fertig!

1. Medium vorbereiten

Einführung

2. Plasmide

5. Ergebnisse

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Passwort eingeben

Ordnet die historischen Meilensteine der Insulinforschung in chronologischer Reihenfolge um das Schlüsselwort zu erhalten. Klickt auf das Auge, für die Auflösung.

Entdeckung von insulinproduzierenden Zellen (I)

Humaninsulin kommt auf den Markt (L)

Leonard Thompson wird als erster Mensch erfolgreich behandelt (S)

Insulin aus Bauchspeicheldrüsen wird diabetischem Hund injiziert (N)

Gentechnischen Verfahrens zur Insulinherstellung mittels E. coli-Bakterien wird entwickelt (E)

WEITER

Passwort eingeben!

2. Plasmide

Alltagsvorstellungen, interaktive Arbeitsbläter und theoretische Einheit zu Plasmiden

Plasmide

Didaktik

Alltagsvorstellungen

Bevor wir beginnen, möchten wir zunächst wissen welche Vorstellungen ihr zu dem heutigen Thema habt. Dazu klickt ihr bitte links auf das Bild und beantwortet stichpunktartig folgende Fragen im Mentimeter. Welche besonderen Eigenschaften zeichnen Plasmide aus? Warum könnten Plasmide bei der Herstellung von Insulin nützlich sein?

Beschriftet die schematische Skizze der Bakterienzelle. Wenn ihr auf die einzelnen Organellen bzw. Kompartimente klickt, öffnet sich ein Fenster in der die Funktion beschrieben wird. Klickt auf das Auge für die korrekte Lösung!

Plasmide

Pili

Plasmid

Didaktik

Nukleoid

Flagellum (Geißel)

Cytoplasma

Zellwand

Zelleinschlüsse

Kapsel

Ribosom

Plasmamembran

Nucleoid

Plasmide

Didaktik

Zellwand

Plasmamembran

Cytoplasma

Ribosom

Zelleinschlüsse

Plasmid

Flagellum (Geißel)

Kapsel

Pili

Plasmide

Didaktik

Interaktive Arbeitsblätter im Biologieunterricht

Welche Vorteile für den Unterricht bieten Interaktive Arbeitsblätter? Was spricht gegen den Einsatz interaktiver Arbeitsblätter? Welche Differenzierungsstrategien werden im vorliegenden Arbeitsblatt angewendet?

Plasmide

Theorie

Was sind Plasmide?

• kleine, in der Regel ringförmige, eigenständig replizierende DNA-Moleküle
• häufig in Prokaryoten zu finden, liegen extrachromosomal vor
• Isolation von Plasmiden ist eine der häufigsten Aufgaben des Molekularbiologen
• können sich selbstständig vermehren
• sind austausch- und übertragbar

Plasmide in verschiedenen Konformationen im elektronenmikroskopischen Bild.

Frage 1/3

Biologie der plasmide

Plasmide werden unabhängig vom Chromosom repliziert.

Falsch

Wahr

Frage 1/3

BIOLOGIe DER PLASMIDE

Plasmide können sich selbstständig vermehren und zählen nicht zum Bakterienchromosom.

Weiter

Wahr

Frage 2/3

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Plasmide liegen ausschließlich in zirkulärer Form vor.

Falsch

Wahr

Frage 2/3

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Falsch! Es gibt auch einige wenige Prokaryoten die lineare Plasmide beinhalten.

Weiter

Falsch

Frage 3/3

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Plasmide enthalten u.a. Resistenzgene gegen Antibiotika.

Falsch

Wahr

Frage 3/3

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Richtig! Plasmide kodieren z. B. Enzyme, die in der Lage sind, Antibiotika zu spalten und sie dadurch unwirksam zu machen.

Weiter

Wahr

Einheiten

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

fertig!

fertig!

fertig!

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Einführung

5. Ergebnisse

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Ordnet die einzelnen Schritte der Plasmidisolation in die richtige Reihenfolge

Plasmid mit Ethanol waschen (ON)

Zellen resuspendieren und aufschließen (ST)

Bakterienzellen abzentrifugieren (RE)

Chromosomale DNA denaturieren und abzentrifugieren (I)

Gelöste Plasmide in neues Reaktionsgefäß überführen (T)

Plasmide mit Isopropanol ausfällen (I)

Zellteile abzentrifugieren (Plasmide bleiben im Überstand gelöst) (K)

RNA abbauen (R)

WEITER

Passwort eingeben

Plasmidisolation

Praxis

Durchführung - Teil 1

Abzentrifugiertes Bakterienpellet

• 2 ml der Bakterienkultur werden 2 min zentrifugiert (Zentrifuge austarieren!)
• den Überstand in den Abfallbeutel pipettieren
• 200 µl Lsg. 1 sowie 2 µl RNase zugeben und das Pellet durch kräftiges Anschnipsen resuspendieren
• 200 µl Lsg. 2 zugeben, 3x invertieren
• 200 µl Lsg. 3 zugeben, 3x invertieren
• 1 min auf Eis inkubieren
• für 2 min zentrifugieren (Zentrifuge austarieren!)
• den klaren Überstand mit einer Pipette abnehmen und in neues Reaktionsgefäß überführen
• den überführten Überstand erneut für 2 min zentrifugieren den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführen (nur klare Flüssigkeit pipettieren)

- Zellen aufgeschlossen - DNA denaturiert - RNA abgebaut

- Bakterienteile abzentrifugiert - Plasmide noch gelöst

- Überstand mit Plasmiden in neues Gefäß überführt

Plasmidisolation

Praxis

Durchführung - Teil 2

• Zugabe von 600 µl Isopropanol zum Überstand, gut mischen
• 5 min auf Eis inkubieren
• für 2 min zentrifugierenden Überstand in den Abfallbeutel pipettieren
• 1 ml 70 % Ethanol auf das Pellet pipettieren, Pellet nicht resuspendieren
• für 1 min zentrifugieren
• Ethanol sehr sorgfältig mit der Pipette abnehmen ohne das Pellet zu zerstören
• Pellet bei Raumtemperatur trocknen (Reaktionsgefäß offen stehen lassen)
• DNA in 30 µl H2O aufnehmen

Gelöste Plasmide mit Isopropanolmischen

- Plasmidpellet am Boden- Überstand entfernen

- Plasmidpellet mit Ethanol zentrifugieren - Restethanol entfernen und trocknen

Einheiten

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

fertig!

fertig!

fertig!

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Einführung

fertig!

5. Ergebnisse

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Kerncurriculum

Didaktik

Das neue KC 2022

• neues KC seit 2022
• relevant für uns im Referendariat
• neue Strukturierung
• Eine Tabelle für jeden Themenschwerpunkt mit Kompetenzen in direkter Übersicht

Download

Aufgabe: Ladet euch das KC herunter und verschafft euch einen groben Überblick über die neue Aufteilung der Kompetenzen sowie die gestalterische Darstellung in den Tabellen. Versucht anschließend die Schwerpunkte der heutigen Einheit im KC begründet einzuordnen.

Schritt 2, wenn ihr die Aufgabesoweit abgeschlossen habt.

Kerncurriculum

Didaktik

Das neue KC 2022

"Der Biologieunterricht der gymnasialen Oberstufe hat primär den Aufbau und die Förderung von Fachkompetenz zum Ziel. In einer digitalen Welt ist es erforderlich, dass sich diese Fachkompetenz auf digitalen Anwendungs- und Handlungsfeldern realisieren lässt. Dies gilt gleichermaßen für die private, gesellschaftliche und berufliche Teilhabe in Gegenwart und Zukunft. Daher gehört digital basiertes Leh- ren und Lernen zum festen Bestandteil von Biologieunterricht. [...] Eine digitalisierte Welt erweitert nicht nur die medialen Möglichkeiten des Lehrens und Lernens, sie hat überdies grundlegende Auswirkungen auf die Biologie als Wissenschaft und somit als Unterrichtsfach. Bei der Erstellung und kontinuierlichen Anpassung des schuleigenen Arbeitsplans ist daher fortwährend zu prüfen, inwieweit digitale Lehr- und Lernangebote den Erwerb von Fachkompetenz fördern können, beziehungsweise inwiefern durch Digitalisierung veränderte Aspekte der Biologie als bildungsrelevant erachtet werden."

• Im neuen KC der Sek II kaum molekularbiologische Methoden vertreten.
• Lediglich PCR und Gelelektrophorese werden erwähnt.
• Dafür aber: 2.3 Fachkompetenz in der digital basierten Welt
• Interaktives Arbeitsblatt
• Lernvideos

Kerncurriculum

Didaktik

Einbindung von Klonierung in das KC

Aufgabe: Erarbeitet aus den Kompetenzbereichen einen Block für das KC unter dem Basiskonzept "Information und Kommunikation". Entscheidet euch dabei für passende Kompetenzen sowohl für den Bereich Sachkompetenz als auch für die prozessbezogenen Kompetenzen (Erkenntnisgewinnung, Kommunikation, Bewertung)

Download

Einheiten

Weiter so! Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

fertig!

fertig!

fertig!

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Einführung

fertig!

fertig!

5. Ergebnisse

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Medium vorbereiten

Methode

Agarplaten gießen

• Nach dem Autoklavieren Medien abkühlen lassen, bis die Flaschen „anfassbar“ sind. Achtung: Agar darf nicht fest werden!
• Vor dem Gießen sterile Zugabe der entsprechenden Zusätze, und erneut aufrühren, damit der Agar und die Zusätze gleichmäßig im Medium verteilt vorliegt
• Gießen von ca. 25 ml Medium pro kleiner Agarplatte (9 cm ∅) und abkühlen lassen.
• Platten bei 4 °C lagern.

Ergebnisse

Ihr habt heute schon ein wenig über Plasmide und ihren Nutzen für die Insulinherstellung gelernt.Nun wollen wir uns angucken, wie ihr zu Beginn der Einheit darüber gedacht habt...

Ergebnisse

Nächste Woche geht es weiter mit... Ligation und Transformation

Einheiten

Alles erfolgreich abgeschlossen! Hervorragend!

fertig!

fertig!

fertig!

2. Plasmide

1. Medium vorbereiten

Einführung

fertig!

fertig!

fertig!

5. Ergebnisse

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Quellenverzeichnis

Campbell, N. A. & Reece, J. B. (aktualisierte Auflage), Biologie, Pearson, München Munk, K. & Dersch, P. (2018). Mikrobiologie. Georg Thieme Verlag. Niedersächsisches Kultusministerium, Kerncurriculum für das Gymnasium – gymnasiale Oberstufe Biologie, 2017 Niedersächsisches Kultusministerium, Kerncurriculum für das Gymnasium – gymnasiale Oberstufe Biologie, 2022 https://www.diabetesde.org/100-jahre-insulin-geschichte-lebenswichtigen-hormons [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://www.mediqdirekt.de/blog/insulin-eine-fast-hundertjaehrige-erfolgsstory [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://flexikon.doccheck.com/de/Resistenzplasmid [zuletzt aufgerufen am 21.05.2022] https://www.onmeda.de/krankheiten/krankheitserreger/bakterien/bakterien-aufbau-id200903/ [zuletzt aufgerufen am 23.05.2022] Bildquellen: https://www.merckmillipore.com/waroot/xl/110283_LB-Agar%20E.coli%20ATCC%2011775%5B110283_LB-Agar%20E.coli%20ATCC%2011775-ALL%5D.jpg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fb/LBmedium.JPG [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://gesundheitslexikon.uniklinikum-dresden.de/bilder/inselzellen-1.jpeg/@@images/151cca59-1a90-41c9-9cca-24a477dc5abd.jpeg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://images-cdn.9gag.com/photo/a8EdOZp_700b.jpg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://tu-dresden.de/ing/maschinenwesen/int/ressourcen/bilder/bioverfahrenstechnik/mikrobiologisches-praktikum-1/Platten_giessen.jpg/@@images/98831563-88aa-401c-92b1-6f6c559a5558.jpeg [zuletzt aufgerufen am 19.05.2022] https://www.tagesspiegel.de/images/imago62748146h/11393786/2-format6001.jpg [zuletzt aufgerufen am 21.05.2022] https://images.saasworthy.com/mentimeter_870_logo_1600681783_e5oqu.png [zuletzt aufgerufen am 20.05.2022] https://i.ytimg.com/vi/5p7yUKJF9kQ/maxresdefault.jpg [zuletzt aufgerufen am 20.05.2022] https://www.industriepark-hoechst.com/media/standortportal/menue/der-iph/historie/d-ue-historie_eb-13-20-insulinplakat_1387_content4.jpg [zuletzt aufgerufen am 20.05.2022] https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ad/Plasmid_em.jpg [zuletzt aufgerufen am 23.05.2022] https://www.aok.de/kp/fileadmin/upload/AOK-BW/Curaplan/Wissen/Curaplan_aktiv_III_Artikel_Curaplan_Wissen_10_Antibiotika_800x500.jpg [zuletzt aufgerufen am 22.05.2022] https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/ad/Plasmid_em.jpg/400px-Plasmid_em.jpg [zuletzt aufgerufen am 24.05.2022] https://studyflix.de/biologie/plasmid-2128 [zuletzt aufgerufen am 24.05.2022] https://www.mentimeter.com/app/presentation/e6dbc23c49c962bb5a85fe19d6f580ed/6e35c51253b5 [zuletzt aufgerufen am 24.05.2022]