Biotecnologia

Biotecnologia

A Revolução da Biotecnologia: Do cDNA ao CRISPR

Elaborado por: Gabriela Magalhães, Leonor Cardoso e Leonor Valpaços

Indice

1. Introdução

2. Ténica do Dna Complementar (cDNA)

3. Reação em cadeia da polimerase- PCR

4. Edição Genética

5. Conclusão

Introdução

O Problema: O DNA das nossas células tem muitas regiões que não codificam proteínas (intrões).

A Solução: Usamos ferramentas moleculares para isolar, copiar e editar apenas as partes que nos interessam.

Com o avanço da ciência, foram desenvolvidas técnicas que permitem estudar o material genético com maior precisão.Entre elas destacam-se o cDNA, a PCR e a edição genética, que permitem analisar, amplificar e modificar o DNA.

Técnica do cDNA

(DNA complementar)

Conceito:

• A técnica de DNA complementar (cDNA) consiste na síntese de DNA a partir de mRNA pela ação da transcriptase reversa, permitindo obter apenas os genes expressos, sem intrões.

1ª ETAPA:

Isolamento do mRNA

• As células são recolhidas e ocorre a lise celular, ou seja, a sua rutura. Depois é extraído e purificado o RNA mensageiro (mRNA), que corresponde apenas aos genes que estão a ser expressos.

2ª ETAPA:

Início da síntese de DNA

• É adicionado um pequeno fragmento de DNA (primer), que serve de ponto de partida para a síntese da nova cadeia.

3ª ETAPA:

Síntese da primeira cadeia de cDNA

• A enzima transcriptase reversa utiliza o mRNA como molde e sintetiza uma cadeia de DNA complementar.

4ª ETAPA:

Remoção do RNA

• A molécula de RNA é removida. Isso pode ser feito por hidrólise ou pela ação de uma enzima RNase H.

5ª ETAPA:

Síntese da segunda cadeia de DNA

• A DNA polimerase sintetiza a segunda cadeia de DNA, utilizando a primeira como molde.

6ª ETAPA:

Formação de cDNA de dupla cadeia

• Obtém-se uma molécula de DNA complementar de cadeia dupla, que corresponde apenas às regiões codificantes dos genes.

APLICAÇÕES:

O cDNA é muito usado em biotecnologia e genética:

• Clonagem de genes;
• Produção de proteínas recombinantes (ex: insulina humana);
• Estudo da expressão genética;
• Criação de bibliotecas de cDNA;

RELAÇÃO ENTRE cDNA E PCR

Reação em cadeia da polimerase- PCR

Conceito:

A PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica usada em biologia molecular para amplificar (copiar) segmentos específicos de DNA, permitindo obter milhões de cópias a partir de uma pequena amostra.

Como acontece a amplificação do DNA na técnica de PCR?

(Envolve três etapas)

Desnaturação (≈95 ºC): Nesta primeira etapa, a temperatura elevada provoca a separação das duas cadeias da molécula de DNA, através da quebra das ligações de hidrogénio entre as bases azotadas, originando cadeias simples que servirão de molde.

Hibridação (45-65ºC):

A temperatura é reduzida, permitindo que os primers se liguem às cadeias molde por complementaridade de bases. Estes primers são essenciais, pois definem a região do DNA que será amplificada.

Alongamento (≈72 ºC):

Nesta fase, a enzima DNA polimerase sintetiza novas cadeias de DNA, adicionando nucleótidos complementares a partir da extremidade 3’ dos primers, copiando a informação da cadeia molde.

As três etapas anteriores constituem um ciclo de PCR, que se repete várias vezes (geralmente 25 a 40 ciclos). Em cada ciclo, a quantidade de DNA duplica, resultando numa amplificação exponencial do fragmento pretendido.

Importância da Taq polimerase:

esta enzima, resistente a altas temperaturas, foi fundamental para o desenvolvimento da PCR, pois mantém a sua atividade ao longo dos ciclos de aquecimento.

Análise de resultados:

após a amplificação, os produtos da PCR podem ser analisados por eletroforese, técnica que permite verificar se o fragmento de DNA foi amplificado com sucesso.

Aplicações da técnica PCR:

-Diagnóstico de doenças-Medicina forense -Testes de paternidade -Investigação científica -Diagnóstico de doenças genéticas -Biotecnologia e engenharia genética -Controlo alimentar e ambiental

Edição genética

A edição genética é uma técnica da biotecnologia que permite alterar o ADN de forma precisa e controlada. Atua diretamente nos genes, podendo removê-los, modificá-los ou inserir novas sequências. Ao contrário de métodos antigos, é mais exata, o que a torna muito útil na investigação científica, na medicina (como correção de doenças genéticas) e na agricultura.

Principio geral da Edição Genética

1. Identificar a região específica do ADN que se pretende modificar;
2. Utiliza-se uma enzima capaz de cortar o ADN nesse local específico;
3. Após esse corte, a célula ativa mecanismos naturais de reparação do ADN.

Principais mecanismo de reparação:

• Junção de extremidades não homologas (NHEJ)
• Reparação dirigida por homologia (HDR)

Técnicas de Edição Genética

CRISPR-Cas9

O CRISPR-Cas9 é um sistema de edição genética baseado num mecanismo natural das bactérias que se defendem de vírus ao guardar fragmentos do seu ADN, e que os cientistas adaptaram para editar genes através de um RNA guia que identifica a sequência de ADN a alterar e da enzima Cas9 que funciona como uma tesoura molecular capaz de cortar o ADN no local exato.

Passo a passo do CRISPR-Cas9

1. O RNA guia e a enzima Cas9 são introduzidos na célula.
2. O RNA guia procura e liga-se a uma sequência específica do ADN.
3. A Cas9 é ativada quando o RNA encontra o alvo.
4. A enzima Cas9 corta as duas cadeias do ADN no local indicado.
5. A célula tenta reparar o ADN de forma natural.
6. Durante a reparação, pode ocorrer:

• desativação de um gene (NHEJ)
• correção de um gene (HDR com molde)
• inserção de uma nova sequência genética

Tipos de Edição Genética

• Knock-out (desativação de um gene)

• Knock-in (Inserção de um novo gene ou substituição de uma sequência defeituosa por uma saudável)

• Edição de base (alteração de apenas uma base do ADN)

• Prime editing (permite alterações complexas)

Aplicações da Edição Genética

Medicina

• Desenvolvimento de terapias para doenças genéticas (ex.: Anemia Falciforme)
• Correção de mutações responsáveis por doenças

• Investigação de tratamentos para doenças neurodegenerativas

• Estudo e possível tratamento de vários tipos de cancro

Agricultura

• Criação de plantas mais resistentes a pragas e doenças
• Melhoria do valor nutricional dos alimentos

• Aumento da produtividade agrícola

Investigação científica

• Estudo da função dos genes

• Compreensão dos mecanismos das doenças

• Desenvolvimento de novos conhecimentos em genética e biomedicina

Limitações e desafios

• Erros fora do alvo (off-target)

• Risco de uso indevido
• Efeitos a longo prazo desconhecidos
• Necessidade de cautela
• Dificuldades técnicas

• Custos elevados

• Regulação e legislação

Questões Éticas

A edição genética levanta preocupações éticas importantes, sobretudo na modificação de embriões humanos, pois as alterações podem ser herdadas por futuras gerações, com possíveis efeitos irreversíveis. Também existe debate sobre o uso para “melhoramento” humano, o que pode aumentar desigualdades sociais e questionar os limites da intervenção na genética.

Caso mais conhecido e polémico

O caso do cientista He Jiankui, em 2018, envolveu a primeira utilização de CRISPR-Cas9 em embriões humanos que resultaram no nascimento de bebés geneticamente modificados. O cientista foi amplamente criticado pela comunidade científica e acabou por ser condenado pelas autoridades chinesas. Este caso destacou a necessidade de regulamentação rigorosa na edição genética humana.

Conclusão

Em conclusão, o DNA complementar, a PCR e a edição genética são ferramentas fundamentais da biologia molecular que, quando utilizadas em conjunto, permitem estudar, analisar e até corrigir o material genético. Estas técnicas complementam-se desde a identificação de genes ativos até à deteção e possível correção de mutações. Assim, representam avanços científicos de grande importância, com aplicações relevantes na medicina, na investigação e na biotecnologia, exigindo sempre uma utilização responsável e eticamente consciente.