AAV9/SLC6A1 gene therapy rescues abnormal EEG patterns and cognitive behavioral deficiencies in Slc6a1-/- mice

AAV9/SLC6A1 gene therapy rescues abnormal EEG patterns and cognitive behavioral deficiencies in Slc6a1-/- mice

Iduna Batazzi

SLC6A1 e encefalopatia infantile

L'aploinsufficienza del gene SLC6A1 compromette la funzione del trasportatore del GABA, determinando l'insorgenza in età infantile di encefalopatia, una sindrome neuroevolutiva rara che colpisce lo sviluppo del sistema nervoso centrale.

L' OBIETTIVO DELLA RICERCA E' QUELLO DI SVILUPPARE E CARATTERIZZARE UNA POTENZIALE TERAPIA GENICA BASATA SUL VETTORE ADENO-ASSOCIATO PER TRATTARE I DISTURBI NEUROEVOLUTIVI LEGATI AL GENE SLC6A1

E' possibile ripristinare l'attività cerebrale (EEG) e il comportamento introducendo il gene umano SLC6A1 tramite il vettore AAV9?

Il tempismo dell'intervento terapeutico determina le probabilità e il livello di recupero clinico?

Quale strategia genica offre il miglior bilanciamento tra efficacia e sicurezza: un promotore ubiquitario o un promotore neurone-specifico?

Disegno Sperimentale

VETTORI: AAV9/MeP229-hSLC6A1 e AAV9/JeT-hSLC6A1

ESPERIMENTO 1: Terapia genica AAV9 MeP e JeT tramite iniezione ICV a P1 (-/-, -/+)

Risultati:

• EEG recupero complessivo delle normali attività cerebrali

• Test comportamentali: è stato testato solo il vettore MeP. Miglioramento in costruzione del nido, memoria, coordinazione e clasping

ANALISI COMPARATIVA DI 3 MODELLI MURINI

Sono stati analizzati tre modelli murini portatori di varianti diverse del gene SLC6A1 per selezionare quello che meglio rappresentasse la complessità e la severità della malattia umana:

• variante umana S295L KI
• variante umana A288V KI
• Slc6a1 KO

E' stato identificato il modello KO (-/- e -/+) come modello più affidabile per testare la terapia genica, perché questi modelli presentano i fenotipi più consistenti e robusti per valutare l'efficacia e la sicurezza del trattamento.

Promotore JeT è stato escluso dai test comportamentali in quanto non sicuro.

Il trattamento a P1 ha mostrato una forte attenuazione dei deficit convulsivi nei topi eterozigoti e sia dei deficit convulsivi che comportamentali nei topi omozigoti.

ESPERIMENTO 2: Terapia genica AAV9 MeP e JeT tramite iniezione i.t. a P5 (-/-, -/+)

Risultati:

• eterozigoti: normalizzazione dell'EEG
• omozigoti:
• EEG: nessuna riduzione delle crisi epilettiche
• Test comportamentali: miglioramento solo nella ricostruzione del nido
• Analisi di RNA-scope

Il trattamento è stato ben tollerato in questa fase dello sviluppo.

Individuata una finestra critica per il trattamento.

ESPERIMENTO 3: Terapia genica AAV9 MeP e JeT tramite iniezione i.t a P10 e P28 (-/-)

VALUTAZIONE EFFICIENZA DI TRASDUZIONE: Terapia genica AAV-PHP eB/MeP-hSLC6A1 tramite iniezione endovenosa a P23 in Slc6a1 KO (-/-, -/+)

STUDIO PILOTA SU TOPI WT: verifica della sicurezza dei vettori in età avanzata

Somministrazione i.t. dei vettori virali MeP e JeT ai topi WT a:

• P10: monitorazione per 6 mesi
• P28: monitorazione per 1 anno

Risultati: somministrazione per entrambi i vettori ad entrambe le età è risultata sicura e ben tollerata dai WT Analisi biochimiche e istopatologiche: sono state effettuate anche analisi del sangue a 3 mesi dal trattamento (AST, TBIL, BUN, CK, ALB) e analisi istopatologiche post mortem. Risultati: tutte le analisi non hanno mostrato alterazioni cliniche rilevanti Analisi di single cell RNA-seq

Replica degli esperimenti con un vettore più potente per verificare se il fallimento osservato a fasi tardive dello sviluppo sia dovuto a una bassa efficienza di trasduzione; Risultati:

• EEG: nessun miglioramento
• Test comportamentali: miglioramento solo nella costruzione del nido
• Analisi RNA-scope

Risultati:

• EEG a P10 e P28: nessuna riduzione delle crisi epilettiche
• Test comportamentali a P10: miglioramento solo nella costruzione del nido
• Test comportamentali a P28: nessun miglioramento

Tentativo di raddoppiamento del dosaggio per escludere fallimenti dovuti a dose insufficiente --> nessun miglioramento

Il trattamento è stato ben tollerato in questa fase dello sviluppo.

Il trattamento è stato ben tollerato in questa fase dello sviluppo.

Il fatto che un vettore così potente e ben distribuito non abbia funzionato a P23 suggerisce che il problema non è la quantità di gene consegnato, ma il tempo dell'intervento.

Analisi di RNA-scope

Tecnica utilizzata per mappare l'espressione del transgene umano nel cervello dei topi trattati, in modo da osservare come il gene si distribuisce in aree chiave del cervello:

• Neocorteccia
• Ippocampo
• Mesencefalo
• Cervelletto

Analisi di RNA-scope duplex: attraverso il grado di sovrapposizione tra l'espressione del gene terapeutico umano inserito (VERDE) e del gene endogeno di topo (ROSSO), si valuta quanto la terapia sia precisa nell'andare a trasfettare le cellule giuste

ANALISI di single cell RNA-seq

Tecnica utilizzata per confrontare l'espressione dell'mRNA del gene originale del topo rispetto a quello umano introdotto con la terapia (effettuata in studio pilota su topi WT per JeT)

• di distribuzione nei cluster
• livelli di espressione in cellule doppio positive

Risultati

I topi eterozigoti rappresentano il modello più accurato per lo sviluppo di terapie per la malattia umana

Il promotore MeP è un buon candidato clinico grazie al suo bilanciamento tra efficacia e sicurezza

Esiste una finestra terapeutica critica per l'efficacia del trattamento

Studi futuri: -perfezionare e aumentare la finestra di intervento -Provare a tradurre accuratamente la finestra temporale murina P1-P4 nella ben più estesa cronologia dello sviluppo cerebrale umano