Tema 12. EL ADN Y LA EXPRESIÓN GÉNICA

Tema 12. EL ADN Y LA EXPRESIÓN GÉNICA

1. EL DOGMA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

El ADN es el portador de la información genética. Las distintas secuencias de bases nitrogenadas del ADN son las responsables de la información genética.

• Griffith (1928)

El factor transformador

(Streptococcus pneumoniae)

• Avery (1944)

Identifica el ADN como portador de la información genética

( Pneumococcus)

• Hershey y Chase (1952)

Demostración experimental con el fago T2

Un gen es un fragmento específico de ADN, es decir, una secuencia de nucleótidos que controla una estructura y/o una función celular.

Un gen estructural es una unidad de transcripción. A partir de un gen se pueden codificar varias proteínas o varios genes pueden codificar una proteína.

• Promotor: región de ADN donde se une a la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

• Región codificante o estructural:secuencia de ADN que se transcribe en proteínas.

• Terminador: secuencia de ADN que señala el final de la transcripción.

En 1958 F. Crick postuló el “Dogma central de la Biología Molecular”,que modificó en 1970 gracias a los avances en bioquímica.

ADN libre en el citoplasmaADN desnudo Casi 100% del ADN sintetiza proteínas Secuencias codificadoras contínuas

CARACTERÍSTICAS GENES PROCARIOTAS

ADN en núcleo y orgánulos citoplasmáticos ( mitocondrias y cloroplastos)ADN unido a histonas Un 10% del ADN sintetiza proteínas, el resto regula la expresión génica Secuencias de nucleótidos repetidas, para darle estabilidad a les estructura del cromosoma. Secuencias codificadoras (exones) disocontínuas, intercaladas por secuencias no codificantes (intrones)

CARACTERÍSTICAS GENES EUCARIOTAS

2. LA replicación

• Proceso mediante el cual, a partir de una molécula de ADN original, se obtienen dos moléculas con la misma secuencia, que la original.

• Previo la división celular, permite la transmisión de información genética a las células hijas.

• En eucariotas se lleva a cabo en el núcleo celular, en la fase S de la interfase.

• En procariotas se lleva a cabo en el citoplasma, durante la bipartición.

• Es semiconservativa (James Watson y F. Crick)y semidiscontínua.

• Tres fases: inicio, elongación y terminación.

Tres hipótesis (experimentos de Meselson y Stahl, con E. coli)

los experimentos de Meselson y Stahl, con bacteria E. coli

replicación en procariotas

1. FASE DE INICIACIÓN

• ORIGEN REPLICACIÓN (ORI C)

La replicación cominza en secuencias determinadas (GATC)

• FORMACIÓN DE LAS HORQUILLAS Y BURBUJAS DE REPLICACIÓN

Las dos cadenas se abren con la intervención de enzimas:Helicasa: rompe puentes de H. Topoisomerasa o girasa: desenrolla la doble helice de ADN. Proteínas SSB: estabilizan las cadenas, y las mantienen separadas

Dos helicasas actuan en sentido opuesto , se originan dos horquillas de replicación, formando la burbuja de replicación. Proceso bidireccional.

2. FASE DE ELONGACIÓN

• Consiste en la formación de nuevas hebras de ADN, complementarias a las originales. Lo lleva a cabo la ADN- polimerasa III.
• Necesita una hebra de ADN molde, la lee en sentido 3'->5'

• Es necesario un cebador o primer (fragmento de 40 nucleótiodos de ARN),con el extremo -OH libre, sintetizado por una primasa (ARN- polimerasa)

• ADN polimerasa III (actividad nucleásica) sintetiza la cadena complementaria y antiparalela (5'->3') a partir del cebador, añadiendo desoxirribonucleótidos- 5- trifosfato (de A, T, G y C) para formar enlaces fosfodiester (con gasto de energía)

FORMACIÓN HEBRA CONDUCTORA O LIDER

• Se forma en sentido 5'->3', a partir de la hebra molde 3'->5'

• Se sintetiza de manera contínua.

• La ADN- polimerasa III , selecciona nucleótidos trifosfato complementarios a los de la hebra molde, hidroliza el enlace fosfodiester y usa la energía liberada para unir el nucleótido monofosfato al extremo 3' libre.

FORMACIÓN HEBRA DISCONTÍNUA O REZAGADA

• Hebra en sentido 3'->5', a partir de la hebra 5'->3', tarda más en sintetizarse por eso se llama retardada.

• Se sintetiza de forma discontínua, mediante fragmentos de Okazaki (1000 a 2000 nucleótidos, se forman a partir de un cebador en sentido 5'-3')

• La ADN- polimerasa III , sintetiza los fragmentos de Okazaki.

• La ADN - polimerasa I, elimina los cebadores( exonucleasa) y rellena los huecos dejados (polimerasa)

• La ligasa une los fragmentos.

3. FASE DE TERMINACIÓN

• Una vez acabada la replicación, la hebra recién sintetizada y la molde se enrollan y originan la doble hélice.

• Proceso rápido, en E. coli, se unen hasta 45000 nucleótidos por minuto.

• Las ADN- polimerasa I, II y III corrigen sus errores, eliminan nucleótidos apareados incorrectamente y los cambia por los correctos (actividad exonucleasa 3'->5')

replicación en eucariotas

Proceso similar con ciertas diferencias:

• Cromosomas muy largos, existen replicones (unidades de replicación que actuan al mismo tiempo) proceso más rápido.

• ADN asociado a histonas , las originales se mantienen en la hebra conductora y las de nueva síntesis (fase S) se unen a la retardada.

• Replicación finaliza al llegar al telómero, al eliminar el último cebador de la retardada la ADN polimerasa no puede completar el hueco y queda incompleta, telómero se va acortando (vejez y cáncer)

• 5 ADN polimerasa:

α sintetiza el ARN cebador y la hélice retardada. β une los fragmentos de Okazaki. γ replica el ADN mitocondrial. δ sintetiza la hebra conductora. ε polimeriza los fragmentos de Okazaki.

CORRECCIÓN DE ERRORES

Lo llevan a cabo las ADN polimerasas y otras enzimas correctoras.

Detección del nucleótido mal apareado: Las enzimas deben diferenciar la cadena antigua de la recién sintetizada; esto se lleva a cabo por la metilación de las citosinas (adeninas en procariotas) añadiendo CH3.

Endonucleasa: cortan y eliminan el segmento que contiene el error. ADN polimerasa I rellena el hueco con la secuencia correcta. Ligasa: une los extremos con los segmento con la cadena.

3. EXPRESIÓN DEL MENSAJE GENÉTICO

• Correspondencia entre secuencia nucleótidos de un gen y la secuencia de aa que se codifica.

• Un gen se expresa,si se transcribe (síntesis de ARN a partir de la cadena molde del ADN 3'->5') y se traduce (síntesis proteínas , colaboran ARNm, ribosomas y ARNt)

• En procariotas se produce de forma simultánea en el citoplasma.

• En eucariotas separados en espacio y tiempo, transcripción en núcleo (ARNm, ARNr y ARNt salen por los poros de la mem. nuclear) y traducción en citoplasma.

• La información génica, se expresa de tres formas:

->Genes con info para sintetizar proteínas, se transcriben y traducen. ->Genes con info para sintetizar ARNr y ARNt, solo se transcriben. ->Genes con secuencias que señalan el inicio y fin de la transcripción no se transcriben, ni se traducen.

TRANSCRIPción en eucariotas

Es necesario:

• Cadena molde de ADN 3'->5'

• Existen 3 ARN polimerasas según el ARN a sintetizar.

• Para el ARNm sintetiza ARN-polimerasa II o transcriptasa: desempaqueta la cromatina; reconoce al promotor gracias a factores de transcripción (proteínas) lee la hebra molde en sentido 3'->5' y selecciona ribonucleótidos 5' trifosfato complementarios (G/C y A/U) , cataliza los enlaces fosfodiéster formando cadena antiparalela 5'->3' formada por ribunucleótidos monofosfato; reconoce secuencias de terminación.

• Tres etapas: iniciación, elongación y terminación.

• El ARN m primario debe sufrir un proceso de maduración, antes de salir por los poros de la membrana nuclear.

1. FASE DE INICIACIÓN

• Existen 3 secuencias reguladoras (promotor, activadoras o enhancers, silenciadoras o silencers); situadas antes del inicio de la transcripción, estos se activan con la unión de factores proteicos y permiten que se forma una “burbuja de transcripción”, en la que la hebra molde de ADN 3'->5´queda accesible a la ARN poli II.

• El promotor o caja TATA (25 nucleótidos justo en la zona de inicio), facilitan que la ARN poli II reconozca la región y se una a ella.

• Secuencias activadoras o enhancers, situada entre 200-1000 nucleótidos del inicio, permiten que la cromatina de desempaquete.

• Secuencias silenciadoras o silencers, intercaladas entre las activadoras, impidiendo que los factores proteicos se unan a ellas, disminuye la velocidad de la transcripción (evitar errores)

2. FASE DE ELONGACIÓN

• La ARN poli II lee la hebra de ADN molde en sentido 3-> 5´(hebra molde), la cadena de ARN transcrito primario, se sintetiza en sentido 5´->3´, añadiendo ribonucleótidos 5' trifosfato (rompe del enlace fosfato del NTP, para catalizar el enlace fosfodiester entre la cadena que se forma de forma antiparalela 5'->3' y el nuevo ribonucleótido 5' monofosfato)

• . La enzima trabaja a razón de 30 nucleótidos por segundo.

• Se transcriben tanto intrones como exones.

3. FASE DE TERMINACIÓN

• La ARN poli II reconoce la secuencia TTATTT, que es una señal de terminación situada en el último exón.
• Se forma un bucle en el ARN transcrito primario,, que hace que se separe del ADN y se cierre la burbuja de transcripción.

MADURACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL

• Adición al extremo 5´del ARN transcrito primario una caperuza de metil guanosina trifosfato. E protege al ARN del ataque de las nucleasas y así evita que sea degradado en el núcleo; además servirá de señal de inicio en la traducción ya que es reconocida por los ribosomas.

• Adición al extremo 3´del ARN transcrito primario una cola poli-A, gracias a la acción de la poli-A polimerasa. Parece ser que tiene un papel protector del ARNm e interviene en la vida media del ARNm, ya que cuanto más corta es la cola, más rápido se degrada el ARN.

• Splicing o mecanismo de corte de intrones y pegado de exones: Se produce en el núcleo y lo realizan un conjunto de ribonucleoproteínas llamadas espliceosoma. Las secuencias intrónicas se enrollan en forma de lazos y se eliminan, mientras que las secuencia exónicas se unen para formar un ARN funcional, que saldrá del núcleo al citoplasma para ser traducido

TRANSCRIPción en procariotas

• Proceso similar a eucariotas.

• Un sólo tipo de ARN polimerasa para la síntesis de todos los tipos de ARN.

• Tiene un promotor (TATATT) sin secuencias activadoras ni silenciadoras y la complejidad de factores transcripción es muy inferior.

• El transcrito primario no necesita maduración porque no tiene intrones.
• En este caso se considera que el transcrito primario es el precursor del ARNt y ARNr, y la separación de cada uno de ellos se puede considerar maduración.

4. RETROTRANSCRIPCIÓN

La retrotranscripción (o transcripción inversa) es el proceso biológico mediante el cual se sintetiza una cadena de ADN complementario (ADNc) utilizando como molde una molécula de ARN. SE lleva a cabo en virus.

5. TRADUCCIÓN

• La traducción o biosíntesis de proteínas, es el proceso mediante el cual se descodifica el mensaje genético que contiene el ARNm para que se sintetice una proteína.

Tres etapas: iniciación, elongación y traducción (antes que nada activación del aminoácido)Se necesita:

• Ribosomas: (ARNr y proteínas). Formados por dos subunidades, una grande y una pequeña. En los ribosomas existen 3 sitios de unión para los ARNt.

• ARN transferente Su función es transportar los aminoácidos hasta el ribosoma, donde los colocan en el lugar correspondiente (que viene determinado por los codones del ARNm.

• ARN mensajero: LLeva transcrito la información del ADN

• Código genético: Establece la correspondencia entre nucleótidos y aminoácidos, lo que permite traducir el idioma de los genes al de las proteínas.

RIBOSOMA

Sitio A (Aminoacilo): Es el sitio de entrada, donde el aminoacil-ARNt que lleva el siguiente aminoácido se une al ARNm. Sitio P (Peptidilo): Sostiene el ARNt que lleva la cadena polipeptídica en crecimiento y cataliza la formación del enlace peptídico. Sitio E (Exit/Salida): Es el lugar de salida por donde el ARNt, ya descargado de su aminoácido, abandona el ribosoma.

ARNt

CÓDIGO GENÉTICO

Relación de correspondencia entre bases nitrogenadas del ARNm y los aminoácidos

Está organizado en tripletes o codones (64 en total) :

- 61 codones codifican 20 aa − el codón AUG además de codificar para metionina, es la señal de inicio − UAA, UAG Y UGA llamados codones sin sentido, señalan el final del mensaje.

• Degenerado o redundante( códigos sinónimos)
• No es ambiguo
• Universal
• No existen solapamientos (lectura secuencia lineal)
• No hay espacios

TRADUCCIÓN EN EUCARIOTAS

Activación del aminoácido (cada aa se une a su ARNt específico)

• Se lleva a cabo en el citoplasma.

• Cada ARNt se une específicamente con un único aa (el aa cuyo codón es complementario al anticodón)

• Aminoacil ARNt sintetasa, se une al brazo D, cataliza enlace entre grupo carboxilo del aa y grupo hidroxilo del ribonucleótido de adenina del extremo 3' del ARNt (secuencia CCA), para ello necesita ATP.

• El ARNt con el aa reconoce el ARNm mediante su anticodón

1. FASE DE INICIACIÓN

Formación del complejo de iniciación: ribosoma + el ARNm + ARNtmet

• Unión de la subunidad pequeña del ribosoma a la caperuza de metilguanosina del extremo 5´del ARNm gracias al factor proteico IF3 (Factor de iniciación).

• La subunidad pequeña recorre el ARNm en dirección 5->3´, hasta que el codón de inicio AUG más próximo al 5, queda en el sitio P del ribosoma.

• Unión del ARNtmet, por la formación de puentes de hidrógeno entre las bases complementarias del anticodón y las del codón (AUG) del ARNm. En este proceso interviene el factor proteico IF2.

• Se acopla la subunidad grande del ribosoma, de forma que cubre 2 codones del ARNm. Interviene el factor proteico IF1. En el sitio P queda el ARNtmet y el sitio A queda libre para recibir al siguiente ARNt con su aa.

2- FASE DE ELONGACIACIÓN

Sintesis de la cadena peptídica por la unión de los sucesivos aa, la peptidil-transferasa que cataliza la formación de los enlaces peptídicos.

• Unión de un aminoacil-ARNt al sitio A del ribosoma (el anticodón del ARNt es complementario del codón del ARNm que se encuentra en el sitio A) En esta etapa se necesita GTP y dos factores proteicos de elongación (EF-Ts y EF-Tu)
• Formación del enlace peptídico: la peptidil-transferasa separa la metionina de su ARNt que hay en el sitio P. Al mismo tiempo cataliza su unión mediante enlace peptídico, al aminoácido que porta el ARNt situado en el sitio A (el dipéptido recién formado queda unido al segundo ARNt, ubicado en el sitio A)
• Traslocación del dipéptido al sitio P: el ribosoma se desplaza sobre el ARN en sentido5´->3´, el codón que lleva unido el ARNt con el dipéptido pasa al sitio P, el sitio A , queda libre, en el se aloja el tercer codón del ARNm.
• El ARNt iniciador (que ha perdido su aa, en este caso metionina) se traslada al sitio E, desde donde será expulsado del ribosoma.
• Un nuevo ARNt, cargado con su aminoácido se coloca en el sitio A, y nuevamente la peptidil-transferasa cataliza la unión del dipéptido con el nuevo aminoácido.

2- FASE DE TERMINACIACIÓN

Finaliza la síntesis de la cadena peptídica, cuando en el sitio A aparece uno de los codones de terminación del ARNm (UAA, UAG, UGA)

• Los factores proteicos de liberación se unen al codón de terminación, impidiendo que algún aminoacil ARNt se sitúe en el sitio A.

• La peptidil-transferasa cataliza la transferencia de la cadena peptídica a una molécula de H2O, (ya que hace reaccionar el grupo carboxilo del último aa con una molécula de agua), lo que provoca la hidrólisis del enlace entre el péptido y el ARNt al que estaba unido.

Como consecuencia de la traducción: − Las dos subunidades del ribosoma se separan y el ARNm puede volver a ser utilizado o se degrada. − se sintetiza primero el extremo N-terminal del péptido y al final el extremo C-terminal. − Se libera la cadena proteica. Posteriormente sufrirá una modificación postraduccional hasta convertirse en una proteína funcional.

modificación postraduccional

• Tras la traducción obtenemos la estructura primaria de la proteína y generalmente su plegamiento es espontáneo hasta que consigue su conformación espacial que le permite tener actividad biológica.

• A veces, el plegamiento no es espontáneo y se requiere la actuación de las chaperonas, que son un grupo diverso de proteínas que se encargan de:

− plegamiento y autoensamblaje de las cadenas peptídicas se lleve a cabo correctamente y con rapidez. − el tráfico de proteínas entre el citosol y los orgánulos celulares. − chaperonas antiestrés reparan las proteínas que se han desnaturalizado en condiciones adversas (falta oxígenos, sustancias tóxicas, aumento temperatura…), con el fin de amortiguar los daños causados por un trauma. (Cabría la posibilidad de que enfermedades como Alzheimer o Creutzfeldt-Jacob se deban a la ausencia o mal funcionamiento de las chaperonas)

La cadena de ARNm suele ser leído por más de un ribosoma simultáneamente formando un polirribosoma o polisoma.

• Todos los ribosomas funcionan de forma similar, pero su localización en el citoplasma depende del destino final de las proteínas:

- Ribosomas libres en el citoplasma: sintetizan enzimas y proteínas que serán exportadas al núcleo, cloroplastos, mitocondria y peroxisomas. -Ribosomas adheridos al RE: sintetizan proteínas estructurales de membrana, hormonas y enzimas de lisosomas.

• Las proteínas tienen un péptido señal (próximo al extremo N-terminal) que decide su destino. en algunas ocasiones, las chaperonas intervienen en el transporte de las proteínas al interior de los orgánulos.

TRADUCCIÓN EN CÉLULAS PROCARIOTAS

− Transcripción y traducción ocurren en el citoplasma. − Los ARNm son policistrónicos (tienen información para varias proteínas. − El ARNm en 5´no tiene una caperuza de de metilguanosina para poder ser identificado por los ribosomas. − Los factores proteicos de iniciación, elongación y terminación son distintos

- La regulación de la expresión génica en procariotas se lleva a cabo mediante el OPERÓN unas proteínas reguladoras controlan la expresión de los genes (en la transcripción) que codifican para enzimas implicadas en una ruta metabólica.