Formation AF4 - Applications

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Formation AF4 - Applications

TOULOUSE FIELD-FLOW FRACTIONATION CENTER

Analyse AF4 nanovecteurs

Analyse AF4 des polymères naturels

Analyse sur le vin

Vin rouge

Vin blanc

Analyse AF4 plastiques dans matrices animales

Analyse AF4 protéines de lait

SNF

Analyse AF4 protéines de blé

Nanoplastiques dans l'eau de la Garonne

Contexte

Analyse du vin

Vin rouge

Dosage et caractérisation des tanins évolués

Unités comprises dans le calcul du DPm

Tanins évolués

Dépolymérisation + Phloroglucinol

Liaison non clivable

Adduits non analysés/analysables

Unité autre que flavan-3-ol (i.e. anthocyane)

HPLC-UV-MS

mésestime la masse molaire

Non adapté pour caractériser les tanins évolués > Impact des tanins évolués sur l’astringence du vin encore mal connu

Contexte

Analyse du vin

Vin rouge

Analyse des polysaccharides

GC-FID

Hydrolyse + Acétylation

• RG-II

• PRAGs

• MPs

FID

Dosages des sucres spécifiques

Permet de doser les différentes familles de polysaccharides

> Ne permet pas de déterminer leur masse molaire

Contexte

Analyse du vin

Vin rouge

Dosage et caractérisation des tanins évolués

Unités comprises dans le calcul du DPm

Polysaccharides (PS) présents dans le vin

Influencé par :

Par le biais :

Interactions tanins - PS

Astringence apportée par les tanins

Réduisent la perception de l’astringence

Astringence résulte d’un système complexe impliquant différentes familles de molécules

Contexte

Analyse du vin

Vin rouge

Fractionnement par chromatographie d’exclusion stérique (SEC)

Tanins

Permet de séparer les molécules en fonction de leur taille par ordre décroissant

Conditions d’analyse très différentes

Polysaccharides

> Distribution de la masse molaire

Ne permet pas d’analyser les complexes macromoléculaires

Objectif

Analyse du vin

Vin rouge

Les techniques d’analyse actuelles ne permettent pas de caractériser la structure des tanins évolués ni d’établir de lien clair avec l’astringence

Les polysaccharides sont également impliqués dans l’astringence via la formation de complexes macromoléculaires avec les tanins

Respecter les interactions fragiles de ces complexes pendant un fractionnement pose aussi un réel défi.

Le Fractionnement par couplage Flux – Force (FFF) a été identifié comme une technique potentiellement efficace pour répondre à ces objectifs

Mise au point conditions analytiques AF4

Analyse du vin

Vin rouge

Phase mobile = matrice vin > respecter au mieux l’intégrité des agrégats et des complexes macromoléculaires

Détermination du seuil de coupure de la membrane

Élaboration du programme d’élution : Réglage du débit du flux croisé

• Étape de relaxation

• Étape d’élution

Volume de vin injecté dans le canal

Évaluation des limites

• Répétabilité – reproductibilité – durée de vie d’une membrane

Mise au point conditions analytiques AF4

Analyse du vin

Vin rouge

Très peu de matière est analysée par les détecteurs de l’A4F.

Ces quelques % peuvent-ils être impliqués dans l’astringence des vins ?

Fractogramme AF4 vin

Analyse du vin

Vin rouge

F1 : Principal de l’absorbance UV

F2 – F3 :

• Caractérisés par deux pics intenses dans le MALS
• Absorbance UV moins intense que F1

F4 : Uniquement visible dans le MALS

Fractogramme AF4 vin

Analyse du vin

Vin rouge

Exemple : Trois échantillons de vins

Fractions = même temps de rétention mais varient en intensité

Analyse des fractions en sortie d’AF4

Analyse du vin

Vin rouge

vin de syrah

• Spectroscopie UV-vis

Analyse des fractions en sortie d’AF4

Analyse du vin

Vin rouge

Spectroscopie UV-vis

Reflète la présence de polyphénols avec des structures complexes

Analyse des fractions en sortie d’AF4

Analyse du vin

Vin rouge

La fraction F1 contient la plus haute concentration en polyphénols + des PS de faible masse molaire

F4 : présence de polyphénols probablement engagés dans des complexes très massifs

Les fractions F2 – F3 contiennent des PS de masses molaires intermédiaires et élevées principalement des PRAGs et des MPs

Présence de polyphénols dans les fractions F2, F3 complexés avec des polysaccharides

Conclusion

Analyse du vin

Vin rouge

Objectif :

• Mettre au point une méthode pour caractériser les macromolecules impliquées dans l’astringence du vin rouge

l’A4F a permis de répondre à cet objectif

Conclusion

Analyse du vin

Vin rouge

Les fractions F2 – F3 contiennent des PRAGs et des MPs

Présence de complexes impliquant des polyphénols

Plus grande part de polyphénols dans F1

Analyse 2D AF4-HPLC du vin blanc

Analyse du vin

Vin blanc

Auriane FIGUE1-3, Mireille GAUCHER1, Marie HENNETIER1, Marianne GOSSET2, Frédéric VIOLLEAU1-3

1- Plateforme Toulouse Field-Flow Fractionation Center, TFFFC, Ecole d'Ingénieurs de Purpan, Toulouse, France 2- Département sciences de l’alimentaire et de la nutrition, Ecole d’ingénieur de Purpan, Toulouse, France 3- Laboratoire de Chimie Agro-industrielle, LCA, Université de Toulouse, INRA, Toulouse, France

Analyse 2D AF4-HPLC du vin blanc

Analyse du vin

Vin blanc

Fractogrammes AF4 des vins blancs

Protéines

Composés Phénoliques ?

Agrégats protéines et polysaccharides ?

Analyse 2D AF4-HPLC du vin blanc

Analyse du vin

Vin blanc

Analyses SDS-PAGE des fractions collectées après l’AF4

Analyse 2D AF4-HPLC du vin blanc

Analyse du vin

Vin blanc

Analyses 2D AF4-HPLC

Analyse 2D AF4-HPLC du vin blanc

Analyse du vin

Vin blanc

Analyses 2D AF4-HPLC

Analyse 2D AF4-HPLC du vin blanc

Analyse du vin

Vin blanc

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Emmanuelle Maria1, Tiago De Oliveira1, Magali Albignac1, Marie Hennetier2, Louisa Landebrit1, Frédéric Violleau2, Gaetane Lespes3, Clément Roux1, Jean François Ghiglione4, Anne-Françoise Mingotaud1, Alexandra ter Halle1

1 Laboratoire des IMRCP, Université de Toulouse, CNRS UMR 5623, Université Toulouse III – Paul Sabatier, Toulouse, France 2 Toulouse FFF Center TFFFC, Université de Toulouse, INP PURPAN, Ecole d’Ingénieurs de Purpan, Toulouse, France 3 Université de Pau et des Pays de l’Adour, E2S UPPA, CNRS, IPREM, UMR 5254, 2 Avenue Pierre Angot, 64053 Pau Cedex, France 4 CNRS, Sorbonne Université, Laboratoire d’Océanographie Microbienne (LOMIC), UMR 7621, Observatoire Océanologique de Banyuls, Banyuls sur mer, France

Focus sur Polymères Naturels en FFF : Xanthane

Analyse AF4 des polymères naturels

Analyse du xanthane par AF4 à différentes concentration

Quand grande concentration : agrégation des chaînes creation de plusieurs pics. Mais un seul pic quand très dilué.

Focus sur Polymères Naturels en FFF : Alginate

Analyse AF4 des polymères naturels

+ on augmente le flux croisé et plus on pert les gros objets de haute masse molaire sur la membrane

NanoVector (NVs) for photodynamic therapy

Analyse AF4 nanovecteurs

Polyoxazolines-based NVs

Analyse AF4 nanovecteurs

Objective and FFF conditions

Analyse AF4 nanovecteurs

Objective : Analyze the synthetized systems to discriminate good nanovector candidate according to the size, form, polydispersity of populations

• Assay on AsFlFFF-MALS-QELS-RI but not a good recovery

> better results with Frit-Inlet AsFlFFF-MALS-QELS-RI (~80% of recovery)

• Spacer 350W, membranes RC 10kDa
• NaNO3 50mM
• Injection of 25ug (2,5mg/ml)
• 6 different polymers without 578 ; with 578 : reticulated (Reti) and non reticulated (NR) by UV

Analyse AF4 nanovecteurs

Frit-Inlet and TEM (Transmission Electronic Microscopy): CoumPPh80-b-MOXA65 (80-65)

Concentration/Rg 80-65

~10% in mass of very small polymers (peak 1)

Analyse AF4 nanovecteurs

Frit-Inlet and TEM: CoumPPh27-b-MOXA59 (27-59)

Concentration/Rg 27-59

~35% in mass of small polymers (Peak 1)

Analyse AF4 nanovecteurs

Frit-Inlet and TEM: CoumPPh27-b-MOXA59 (27-59)

Concentration 8-42

~60% in mass of small polymers (at 2-12min) => × too many 4-48 and 57-33 systems have also to much quantities of peak 1

Analyse AF4 protéines de lait

Project Context

Acidic protein beverages are made with whey protein

Goal: To use the casein as ingredient in acidic protein beverages

Analyse AF4 protéines de lait

Casein micelle state

Acidic conditions

Caseine micelle

Not stable

Enzyme Transglutaminase (mTGase)

Modification and reinforcement of the casein micelle structure

Analyse AF4 protéines de lait

Enzymatic casein treatment

2 H

8 H

• Size Exclusion Chromatography (SEC)
• AsFlFFF-MALS-QELS-RI

3 U enzyme/ g protein 40°C

Inactivation 70°c 10 min

18 H

pH 7.0

pH 3.0 HCI

Micellar casein powder hydration 2,7% w/w 50°C – 8 h

24 H

No enzyme

AsFlFFF-MALS-QELS-RI

pH 7.0

pH 3.0

Analyse AF4 protéines de lait

Objective and AF4 conditions

Objective : Analyse caseins by AsFlFFF-MALS-QELS-RI to apprehend size and structure difference of micelles with the reticulation and between pH 7 and pH3

• AsFlFFF-MALS-QELS-RI (Dualtec)
• Short Channel (SC), Spacer 490W
• membranes PES 10kDa (nothing come out the channel with RC at pH3)
• Calcium/Phosphorus (same concentration than medium soluble of samples)

Analyse AF4 protéines de lait

AF4 Fractogram of casein micelles at pH7

Fractogram (AF4)

Peak 1

Peak 2

Peak 3

Peak 1 : Whey Proteins

Peak 3: Particles corresponding to a casein micelle

Peak 2 : Small casein assemblies with an Rg < 10 nm

Analyse AF4 protéines de lait

Apparent density of casein micelles at pH7

Apparent density

When Rg = 100 nm

Cross-linking of caseins -> gradual decrease in size resulting in the formation of small and dense particles

Analyse AF4 protéines de lait

Shape factor of casein micelles at pH7

Shape

Rg/Rh : Qualitative measurement of the conformational forms of aggregates

Elongated structures due to non-covalent interactions.

Analyse AF4 protéines de lait

Shape factor of casein micelles at pH7

Shape

Rg/Rh : Qualitative measurement of the conformational forms of aggregates

Towards smaller and spherical objects formation.

Analyse AF4 protéines de lait

AF4 Fractogram of casein micelles at pH3

At pH3, the peak 2 (little assemblies of caseins) is more important than at pH7 for non or partial-crosslinking casein -> Micelles are not stable

The more the casein are crosslinked the more the micelles quantities increase -> mTGase allows to stabilize micelles at pH3

Analyse AF4 protéines de lait

Apparent density of casein micelles at pH3

When Rg = 100 nm

At pH 3.0, cross-linked particles are denser than non-modified micelles.

Micelles are less dense at pH3 than at pH7.

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Context: Enhanced Oil Recovery (EOR)

There are 3 types of oil recovery:

EOR : Water-soluble polymers flooding

• Increase the water viscosity η
• Modifying mobility ratio between oil and water
• Improves the vertical and areal sweep efficiency

Properties of Polyacrylamides (PAMs):

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Viscosity of Polymers with different molar mass at different concentration

• The objective to do Enhanced Oil Recovery is to increase viscosity of polymer solution
• When molar mass of polymer increases, the viscosity become more important
• To increase the viscosity, it’s better to use high molar mass polymer at low concentration

Properties of Polyacrylamides (PAMs):

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Frit-Inlet AF4

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

PAMs have the particularity to entangle the polymer chains

Use of Frit-Inlet to avoid focus step and decrease this phenomena

Frit-Inlet AF4 method

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Frit-Inlet AF4/LC spacer 490µm/RC 10kDa/20µg injected

Results with Frit-Inlet AF4 method

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Use of Low Flows

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

For trying to avoid steric mode for high molar mass polymer

Use of very low flows in AF4 methods

Results of AF4 method with low Flows

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Industrial Polymer

Results of AF4 method with low Flows

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Industrial Polymer

MALS Signal of IND

Entanglement of the chains

For High molar mass polymers: the more the injected quantity increase, the more the polymer is entangled and exit in steric mode: injection less than 2µg for highest molar mass

Results of AF4 method with low injected quantity

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Industrial Polymer

MALS Signal/Mw distribution of IND

Mw distribution of Ind4 is flat and the polydispersity is too low -> MALS signal is too low at 2µg

Analysis by AF4: use of DCM™ option

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

Dilution Control Module™ (Wyatt module)

• The system draws buffer before the channel outlet and concentrates the sample
• The signals are more important

Analysis by AF4: use of DCM™ option

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

• It important to keep 0,2 ml/min of Chanel flow to have normal mode
• To concentrate by 4 the Detector Flow must be at 0,05ml/min

Analysis by AF4: use of DCM™ option

SNF

Analysis of ultra-high molar mass polyacrylamides used for oil extraction by Asymmetrical Flow Field-Flow fractionation

• The signal is enough important for the Mw calculation by the MALS
• Mw distribution is growing
• Significant errors is very low
• Good recovery rate

Analyse AF4 plastiques dans matrices animales

Nano/micro plastic dans des matrices complexes

Biblio : organes sexuel poisson :

• Traitement enzymatique + filtration
• AF4/MALS/RI : fractionement par taille + calcul taille et quanti
• collectes pics + concentration -> Raman/Microscopie Electronique (SEM/EDX)

Andrea Valsesia (2021)

Nano/micro plastic dans des matrices complexes

Analyse AF4 plastiques dans matrices animales

Andrea Valsesia (2021)

Analyse AF4 protéines de blé

Bread Making

Crucial step to obtain a dough and a Gluten network

Gluten Network

Analyse AF4 protéines de blé

Water

Energy

Gluten

Storage proteins (≈ 80% of the total proteins of the flour)

Protein extraction

Analyse AF4 protéines de blé

SE-HPLC

Analyzed

Information on individual proteins behaviour

Denaturing condition (SDS + Sonification)

• Broke the weak interaction

AF4

Information on proteins assemblies

Proteins sample

Mild condition (Water/Ethanol)

Analyzed

Information on individual proteins behaviour

• Keep the weak interaction

SE-HPLC

Protein assemblies

Analyse AF4 protéines de blé

Spherical object of 100 nm obtained by convalent and weak interaction of glutenins and specific gliadins

The assemblies content is related to the wheat rheological properties

Flour quality

Ramos, L., Banc, A., Louhichi, A., Pincemaille, J., Jestin, J., Fu, Z., Appavou, M.-S., Menut, P., & Morel, M.-H. (2021). Journal of Physics: Condensed Matter, 33(14) Morel, M.-H., Pincemaille, J., Chauveau, E., Louhichi, A., Violleau, F., Menut, P., Ramos, L., & Banc, A. (2020).Food Hydrocolloids.

Materiel & Method – Proteins analysis

Analyse AF4 protéines de blé

Asymmetrical Flow Flow Field Fractionation (Wyatt)

Size-exclusion High Performance Liquid Chromatography (SE-HPLC)

Conditions : Channel long size (26,5 cm) Spaceur : 350 µm Eluant : Water/Ethanol (50/50, v/v) (2,88 cP at 20°C) Channel Flow : 0,6 mL/min

Conditions : Column : TSK gel G4000SWXL + TSK Guard Column Eluant : 0,1M Phosphate + 0,1% SDS Sample Solvent : 0,1 M Phosphate + 1% SDS + 6M urea Detectors : UV at 214 nm

Chromatographie d’exclusion stérique

Analyse AF4 protéines de blé

Chromatographie d’exclusion stérique

Analyse AF4 protéines de blé

Proteins extraction

Velasko flour

Thesee flour

Soissons flour

AF4 Proteins fractionation

Analyse AF4 protéines de blé

Not mixed

Mixed 360 sec

AF4 Proteins fractionation

Analyse AF4 protéines de blé

Quantity of polymers (object between 105 and 106 g/mol)

Molecular size evolution of proteins

The mixing duration tends to increase the polymers quantity and the molar size of the objects

Assemblies Properties

Analyse AF4 protéines de blé

Molar Size evolution of assemblies

Density evolution of assemblies (Hard sphere model and Rg is used for the calculation)

Conclusion

Analyse AF4 protéines de blé

Thank to SEC : Impact of mixing on proteins quantity Impact of the varieties

Thank to AF4 : Discriminitation of wheat quality Impact of mixing on the assemblies

Perspectives :

Understand how the proteins quantity/concentration impact the formations of the assemblies ?

Analyzed each fraction in SDS-PAGE

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Les fleuves sont les principaux vecteurs de pollution plastique

• Beaucoup d’études sur les macroplastiques mais peu sur les nanoplastiques
• Prélèvement de l’eau de la Garonne avant et après Toulouse

Objectifs de l’étude :

1) Échantillons fractionnés par FFF

2) Caractérisation physico-chimique off-line

Field-Flow Fractionation

Py-GC-MS

ICP-MS

TEM

Collecte de fractions

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Fractogramme AF4

Préparation échantillon Eau Garonne

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Fractogramme AF4

Préparation échantillon Eau Garonne

-> Ajout d’un potentiel électrique dans le canal

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Collectes de fractions sortie EAF4

• 3 populations sont collectées
• 15 injections d’échantillons d’eau de la Garonne

-> 15 collectes ont été effectuées puis réunies pour avoir assez de quantité de matière

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des collectes en Pyrolyse-GC-MS

• Les analyses en Py-GC-MS montrent que du plastique est bien présent dans l’eau de la Garonne
• 3 polymères sont majoritaires : PET, PE, PP
• La majorité de la quantité de matière a été détectée dans la population F1

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des collectes par ICP-MS

• Des traces de métal sont présentes dans les 3 fractions mais avec des distributions distinctes
• Elements seulement présents dans le F3 : Pb, La ; seulement dans F2: Cr ; et en majorité dans la F1 : Ba

-> Le fractionnement par taille en Electrical-FFF n’est pas évident mais chaque fraction a une composition chimique différente

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des nanoplastiques dans l’eau de la Garonne par Electrical-AF4 couplée à d’autres techniques

Analyse des collectes par TEM-EDX

MET : 3 fractions polydisperses de 50nm à 1µm

• F1 : matière organique colloïdale naturelle
• F2 : particules inorganiques
• F3 : Agrégation hétérogène entre matière organique et particules inorganiques

Fin

Formation AF4 - Applications

AF4 Fractogram of casein micelles at pH7

Peak 3

Peak 3: Particles corresponding to a casein micelle