Formation AF4 - Développement de méthode

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Formation AF4 - Développement de méthode

TOULOUSE FIELD-FLOW FRACTIONATION CENTER

1) Choix de l’éluant : Biblio + test influence concentration en sel ou type sel

2) Choix du canal (LC ou SC)

3) Choix de la quantité injectée

4) Choix du cross-flow

5) Vérificaction du taux de recouvrement

7) Mode hyperlayer

6) Mode sérique

8) Mode sérique et cross-flow

9) Mode sérique et spacer

Choix de l’éluant : Biblio + test influence concentration en sel ou type sel

Étape développement de méthode sur échantillon inconnu

Exemples Influence du solvant

Liposomes

Fig. 2. Influence of the carrier solution components: a) PBS (blue line), b) HEPES (green line), c) HEPES+NaCl (red line), in the liposome AF4-MALS analysis (using Ls-CV). The fractogram shows the light-scattering signal at 90° of the entrapped liposomes versus the elution time. (Each color line shows the used carrier)

Exemples Influence du solvant

Fractogramme des caséines micellaires natives (concentration) avec l'utilisation de différents éluants

Micelles se déstabilisent quand on n’ajoute pas de calcium dans l’éluant -> Ponts calciques qui maintiennent la micelle se dissocient

Exemples Influence du solvant

Liposomes

Quand sel=0mM : charge non écranté et Potentiel Zeta très fort et négatif -> objets très repoussés de la membrane, elution très rapide

Choix du canal (LC ou SC)

Étape développement de méthode sur échantillon inconnu

Choix de la quantité injectée

Étape développement de méthode sur échantillon inconnu

Influence de la quantité de matière injectée

Liposomes

Quand trop de matière injectée : Rayons + grands -> agrégation artificielle

Choix du cross-flow

Étape développement de méthode sur échantillon inconnu

Influence du Cross-Flow

Liposomes

Influence du Cross-Flow

Liposomes

Quand objets très polydisperse : on préfère une exponentielle à une isoforce car pic “traîne” moins

Influence du Cross-Flow

Micelles de caséines + protéines sériques

Signal Refractomètre

Vérificaction du taux de recouvrement

Étape développement de méthode sur échantillon inconnu

Il faut verifier que tout ce qu’on injecte sort du canal :

Soit on possède le dn/dc des échantillons dans l’éluant et dans ce cas astra calcule un taux de recouvrement en %

Soit nous ne connaissons pas le taux de recouvrement et nous injectons l’échantillon sans cross-flow ni focus pour obtenir une aire d’un pic total et comparer avec l’aire de notre méthode AF4

Étape développement de méthode sur échantillon inconnu

Liposomes

Étape développement de méthode sur échantillon inconnu

Si le taux de recouvrement est faible :

Mode sérique

Mode hyperlayer

Mode sérique et cross-flow

En mode stérique l’augmentation du cross-flow ne fait pas augmenter le temps de retention Il le fait même diminuer.

Mode sérique et spacer

Le point d’inversion augmente avec le spacer -> On privilégie un grand spacer pour rester en mode normal

Fin

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