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Spettrofotometria UV-Visibile

valentina dinoia

Created on January 26, 2026

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Transcript

spettrofotometria

UV-Visibile

COS'E'?

E' una tecnica analitica che misura quanto una sostanza assorbe luce a determinate lunghezze d'onda, per determinare concentrazione o caratteristiche chimiche. Si basa sull'assorbimento selettivo, da parte di molecole, delle radiazioni con lunghezza d'onda compresa fra 10 e 780 nm. La gamma spettrale viene divisa in tre regioni principali: -UV lontano (10-200 nm). -UV vicino (200-380 nm). -Visibile (380-780 nm).

INDEX

09. tipi di spettrofotometro

01. strumentazione

05. monocromatore a filtro

02. com'è fatto?

10. che tipo di analisi?

06. prisma e reticoli

11. analisi qualitativa e quantitativa

03. sorgenti

07. cella

12. la legge di lambert-beer e le due teorie

08. celle o cuvette e rivelatori

04. monocromatori

01. STRUMENTAZIONE

Gli spettrofotometri possono essere di due tipi: semplici: e complessi:

COLORIMETRI:Il colorimetro è uno strumento relativamente semplice che misura l’assorbimento della luce nel campo del visibile (circa 400–700 nm). Usa una sorgente luminosa (di solito LED), la luce passa attraverso un filtro colorato che seleziona una banda abbastanza ampia di lunghezze d’onda, la luce attraversa il campione ed un rivelatore misura la luce trasmessa.

SPETTROFOTOMETRI VERI E PROPRI: Lo spettrofotometro è uno strumento di precisione che misura l'intensità della luce a diverse lunghezze d'onda per determinare la concentrazione, la purezza e le caratteristiche chimiche di una sostanza.

02. come è fatto lo spettrofotometro?

modo schematico

Schema a blocchi:

SISTEMA DI ELABORAZIONE SEGNALI

COMPARTIMENTO CELLE

LAMPADA

MONOCROMATORE

RIVELATORI

03. SORGENTI

Sono lampade che emettono radiazioni nel campo dell'UV/vis.

Nella regione dell'UV:

Nella regione del visibile:

  • lampada a deuterio (sotto i 400 nm).
  • lampade a filamento di tungsteno (930-330 nm).

Dispositivo ottico che seleziona una singola lunghezza d'onda della luce (o una banda molto stretta) a partire da una radiazione policromatica emessa dalla sorgente .

04.monocromatori

Si può dividere in monocromatore a filtro e monocromatore a elemento disperdente.Quello a filtro si basa su filtri (ottici o interferenziali) che bloccano una parte della luce e lasciano passare solo la parte desiderata. Quelli a elemento disperdente (prisma o reticolo) separano le varie componenti della radiazione e ne permettono la successiva selezione della banda desiderata.

05.monocromatore a filtro

I filtri ottici contengono sostanze che assorbono gran parte della luce visibile e lasciano passare solo una certa banda di lunghezze d'onda. Questa banda è larga circa 250 nm.Anche usando più filtri insieme, la banda che passa rimane comunque abbastanza ampia (circa 50 nm) e inoltre l’intensità della luce diminuisce, anche per le lunghezze d’onda che ci interessano. Per questo motivo questi filtri si usano solo nei colorimetri.

06.prisma

Il prisma è in grado di disperdere le radiazioni con diversa lunghezza d'onda (λ) grazie al fenomeno della rifrazione. Quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro subisce una deviazione di un angolo inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda della radiazione, perciò radiazioni con diversa λ subiscono diversa deviazione.

06.reticoli

Svolgono la stessa funzione del prisma, ma il loro funzionamento è basato sulla riflessione. I reticoli sono una superficie con tante linee/fenditure parallele molto vicine tra loro. Quando la luce colpisce il reticolo viene riflessa da tante linee diverse, i raggi si combinano tra loro (interferenza) e ogni lunghezza d'onda va in una direzione diversa.

07.cella

La cella o cuvetta è il contenitore dove metti il campione (di solito una soluzione) da analizzare. Praticamente la luce passa attraverso il campione dentro la cuvetta, e lo strumento misura quanta luce viene assorbita. La cuvetta deve essere trasparente alla luce usata e deve avere un cammino ottico (lunghezza del percorso della luce) ben preciso. Più è lungo il cammino più luce viene assorbita. Materiale della cella: -in UV si utilizzano celle in quarzo; -nel visibile in vetro o alcuni materiali plastici;

08.celle o cuvette

Possono essere di vario tipo a seconda dell'uso e dello strumento:

  • a sezione circolare in vetro ottico con diametro da 1 a 5 cm (per colorimetri monoraggio);
  • a parallelepipedo di sezione quadrata con cammino ottico da 1 cm (sono comunque disponibili varie misure). Possono essere di vetro per il visibile e di quarzo per UV/vis.

08.i rivelatori

Nell'UV-visibile si possono utilizzare:-celle fotovoltaiche e celle fotoconduttive (trasformano direttamente la luce in corrente e sono semplici ma meno sensibili); -fototubi e fotomoltiplicatori (sono molto più sensibili e riescono a rilevare anche pochissima luce); -fotodiodi (molto usati negli strumenti moderni, veloci e affidabili e spesso usati in array, cioè più sensori insieme).

Sono la parte che misura davvero la luce. In pratica arriva la luce dal campione, il rivelatore la "colpisce" ed esso la trasforma in un segnale elettrico (più luce arriva più è grande il segnale, meno luce arriva più è piccolo il segnale), questo segnale poi viene mostrato sullo schermo. I rivelatori sono importanti perchè determinano sensibilità e l'accuratezza dello spettrofotometro.

09.tipi di spettrofotometro

  • Spettrofotometri monoraggio: misura prima il bianco e poi il campione. Fa una misura alla volta.
  • Spettrofotometri a doppio raggio: il raggio di luce viene diviso in due (uno passa nel campione e uno nel bianco). Le due misure vengono confrontate.
  • Spettrofotometri a serie di diodi: solo UV-visibile. Usa tanti fotodiodi e misura tutte le lunghezze d'onda insieme.
  • Strumenti in trasformata di fourier: solo infrarosso (IR). Non separa le lunghezze d'onda una alla volta e usa un segnale complesso applicando poi la trasformata di Fourier per ottenere lo spettro.

10. che tipo di analisi?

  • Analisi qualitativa: serve a capire che sostanza è. In pratica ogni molecola assorbe la luce in modo diverso (questo dipende dalla sua struttura elettronica). Perciò lo spettro è come un'impronta digitale.
  • Analisi quantitativa: serve a capire quanta sostanza c'è. Più la sostanza è concentrata più luce viene assorbita. Esiste una relazione precisa per questo, ovvero la legge di Lambert-Beer.

La spettrofotometria UV-vis permette di ottenere analisi sia quantitative che qualitative su sostanze solubili dotate di gruppi in grado di assorbire energia nel campo delle radiazioni UV-visibile.

11. analisi qualitativa e quantitativa

-ANALISI QUANTITATIVA:si utilizza una luce monocromatica (cioè con una sola lunghezza d'onda) perchè si vuole una misura molto precisa. Quando una radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente a seconda della concentrazione. Perciò l'assorbimento dipende dalla concentrazione. Disponendo quindi di strumenti in grado di misurare l'assorbimento si risale facilmente alla concentrazione della soluzione. All'inizio la luce entra nella soluzione con intensità I₀, dopo aver attraversato la soluzione avrà un'intensità I. Se la sostanza assorbe: I < I₀. Se non assorbe: I = I₀

-ANALISI QUALITATIVA:si utilizzano raggi policromatici a spettro continuo, poi separati tramite monocromatori nelle varie componenti. Le singole radiazioni vengono fatte passare una alla volta attraverso la sostanza in esame, la quale assorbirà in modo diverso le diverse radiazioni. Poi si riportano i valori registrati in un grafico lunghezza d'onda-assorbimento, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza esaminata. Essendo che ogni sostanza ha il proprio spettro, lo si può confrontare con spettri noti per identificare essa o il suo grado di purezza.

12. legge di lambert-beer

Secondo la legge di Lambert – Beer, dunque, l’assorbanza A è proporzionale sia alla concentrazione della sostanza assorbente, sia allo spessore dello strato attraversato (per cui più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà l’assorbanza). Da notare che il coefficiente di estinzione molare ε indica il valore di assorbanza del composto in esame quando [b= 1 cm] e [ c = 1 mol/L], e il suo valore dipende dalla λ della radiazione assorbita, dalla natura del solvente, dal pH e dalla specie chimica che assorbe.

Esiste una legge che ci permette di calcolare la concentrazione di campione dal suo assorbimento; questa è la legge di Lambert–Beer, che assume la forma: A=ε * c * b. A=assorbanza del campione. ε=coefficiente di estinzione molare, specifico per ogni sostanza e dipende dalla lunghezza d'onda della radiazione assorbita. c=concentrazione (mol/L). b=cammino ottico (cm).Questa legge esprime una proporzionalità diretta tra la concentrazione di una specie in soluzione e l'assorbimento di una radiazione a una determinata lunghezza d'onda.

Info

Info

Le soluzioni devono sempre essere diluite al massimo, compatibilmente con la sensibilità dello strumento, per avere dei valori accettabili di assorbanza. Le radiazioni luminose che devono attraversare la soluzione in esame devono essere monocromatiche. Ma in realtà non esiste nessuna luce perfettamente monocromatica, si usa invece una banda molto ristretta di lunghezze d'onda centrata su una lunghezza d'onda precisa. Perciò va bene lo stesso perchè tutte le radiazioni si comportano quasi ugualmente, l'errore è piccolo e i risultati sono comunque affidabili.

12.CONDIZIONI DI LAVORO

Una specie chimica può essere determinata quantitativamente per via spettrofotometrica solo se assorbe nel campo dell'UV-vis o del visibile. In pratica la specie è di per se un cromoforo o può essere trasformata in un cromoforo. Occorre quindi preparare il campione in modo da ottenere un cromoforo ottimale. Per preparare il campione: 1. si eliminano le interferenze tramite agenti complessanti e precipitanti; 2. si regola il pH usando un tampone per avere condizioni ottimali; 3. si stabilizza l'analita aggiungendo appositi reagenti se necessario; 4. si standardizzano i tempi di lettura delle assorbanze. La soluzione da analizzare deve essere limpida. Per la scelta della lunghezza d'onda, si sceglie la λ dove l'assorbimento è massimo (questo perchè maggiore assorbanza=maggiore sensibilità, si riescono a misurare anche piccole concentrazioni e ci sono minori errori sperimentali). La lunghezza d'onda dove l'assorbimento è massimo lo si trova nello spettro.

12. USO DELLA LEGGE DI LAMBERT-BEER NELL'ANALISI QUANTITATIVA

12. teoria degli orbitali molecolari

Gli atomi interagiscono tra di loro per formare molecole così da raggiungere uno stato di maggiore stabilità quindi minore energia. L'interazione avviene a causa della formazione di legami covalenti. Per descrivere la formazione di un legame chimico si fa riferimento a due teorie: la teoria del legame di valenza (valence bond) e la teoria dell'orbitale molecolare. La prima dice che ogni atomo ha elettroni negli orbitali e quando due atomi si avvicinano i loro orbitali si sovrappongono mettendo in comune gli elettroni e facendo nascere così un legame.

Perciò quando due atomi si legano, sovrappongono i loro orbitali secondo due modalità: frontale (forte, detta di tipo σ) e laterale (debole, detta di tipo π); si formano così dei nuovi orbitali, detti orbitali molecolari, di tipo sigma (σ) e pi greco (π).

12. teoria degli orbitali molecolari

La seconda teoria invece dice che quando due atomi si avvicinano per formare una molecola, in realtà si forma un unico orbitale molecolare bicentrico (ovvero tutti gli orbitali atomici, e non più solo quelli di valenza, si combinano insieme per dar luogo solo a orbitali di tipo molecolare). Quindi avremo una serie di orbitali molecolari che hanno come centro i 2 nuclei dei due atomi che formano la molecola. Inoltre l'orbitale molecolare bicentrico contiene due elettroni con spin antiparallelo.Per ogni orbitale di legame a minore contenuto energetico se ne formerà uno a maggiore contenuto energetico di antilegame. Ma si può formare anche un orbitale n di non legame per quegli atomi che hanno dei doppietti negli orbitali di valenza (per esempio l'alcol metilico o metanolo). Nel caso degli orbitali molecolari, quel doppietto libero subisce una trasformazione, dovendo diventare un orbitale molecolare (nella realtà però restano più legati all'atomo di origine).

12.le transizioni energetiche

Un oggetto è colorato perchè assorbe alcune parti della luce e riflette le altre. La luce bianca contiene tutti i colori e se una sostanza assorbe certe lunghezze d'onda, noi vediamo quelle che restano. Per esempio se assorbe il verde noi vediamo il viola. Gli elettroni nelle molecole possono saltare da un livello energetico ad un altro quando assorbono energia (luce). Il principio base è ΔE=hv, cioè se la luce ha l'energia giusta viene assorbita, altrimenti passa o viene riflessa. Una molecola è colorata se assorbe luce nel visibile (380-720 nm). Ciò succede quando sono presenti insaturazioni (doppi legami) ed elettroni liberi (n) (come quelli su ossigeno e azoto). Gli elettroni hanno diversi tipi di salti:

  • σ-->σ* (serve tanta energia UV; non vediamo il colore).
  • π-->π* (serve energia media; spesso nel visibile).
  • n-->π* (serve poca energia; spesso visibile).
Solo gli ultimi due danno colore.

Se invece la concentrazione è troppo elevata la legge subisce una deviazione e la proporzionalità viene a mancare: al crescere della concentrazione del soluto si verificano deviazioni notevoli con conseguente scarsa attendibilità del dato analitico.Quando la soluzione è molto concentrata le particelle interagiscono tra di loro (si creano urti e forze intermolecolari), si formano aggregati (le molecole si attaccano fra di loro, perciò assorbono luce in modo diverso rispetto all'inizio), cambia l'assorbimento (può cambiare l'intensità e può spostarsi il massimo di assorbimento) infine di consenguenza lo spettro non è più quello previsto e la relazione tra A e c non vale più.

La legge di Lambert-Beer è un'astrazione, essendo valida solo per soluzioni molto diluite. y=assorbanza x=concentrazione