Métodos de purificación y caracterización de proteínas

Métodos de purificación y caracterización de proteínas

Baltazar Torres Wilfrido Emanuel 1A

Preparación de muestra / condiciones generales

Fraccionamiento inicial

Métodos analíticos para monitoreo y caracterización

Cuantificación total

Electroforesis

Espectometría de masas

Conformidad y estabilidad

Principales métodos cromatográficos

Interacción hidrofóbica (HIC)

Cromatografía en fase reversa (RP)

Intercambio iónico

Afinidad (Affinity chromatography)

Exclusión por tamaño / filtración en gel

Referencias bibliográficas

• Como objetivo liberar la proteína sin degradarla. La temperatura a(4 °C) y usar inhibidores de proteasas si requiere.
• El pH cercano a estabilidad de la proteína, sal (NaCl) moderada para evitar agregación, agentes reductores si la proteína contiene puentes disulfuro y se requiere reducirlos.
• Cuantificar proteína total y actividad (si hay ensayo funcional).

Precipitación con sulfato de amonio (salting-out): Separa por solubilidad, se hace por % de saturación para concentrar y eliminar proteínas solubles diferentes. Ventaja: económico, escala grande. Desventaja: puede co-precipitar impurezas y afectar actividad si no se optimiza. Centrifugación diferencial / ultracentrifugación: Para eliminar restos celulares, membranas o separar complejos grandes, asi como extracción y lisis específicos.

Intercambio iónico (IEX)

Tiene como objetivo la separación según su carga neta. Son columnas con grupos cargados (análogos: DEAE aniónico; CM catiónico). La proteína se enlaza a la matriz según su carga a ese pH y se eluye por gradiente de sal. Se usa cuando la proteína tiene pI diferente de la mayoría de contaminantes. Excelente para step de enriquecimiento. Tiene la ventaja de alta capacidad, escalable. Tiene la desventaja de que es sensible a pH y fuerza iónica; puede desestabilizar proteína si se eluye con sal alta.

Exclusión por tamaño / filtración en gel (SEC / GF)

• Como objetivo tiene que por una matriz porosa separa según tamaño hidrodinámico: las moléculas grandes salen primero.

• Se usa en pulido final, estimación de peso molecular nativo, eliminación de agregados.

• Tiene varias limitantes como una baja capacidad y resolución limitada para tamaños cercanos.

Afinidad (Affinity chromatography)

• Tiene como objetivo la unión específica entre proteína y ligando (anticuerpo, Ni-NTA para His-tag, GST-glutatión, etc.). Elución por competidor o cambio de pH/imidazol.

• Potencia: puede dar purificación muy alta en un solo paso para proteínas recombinantes etiquetadas.

• La etiqueta puede alterar actividad; se suele eliminar con proteasa de sitio y volver a pulir.

Cromatografía en fase reversible

• Usada para péptidos o análisis (no tanto para proteína nativa porque desnaturaliza).
• Útil en preparación para MS.

Interacción hidrofóbica (HIC)

• A altas sales, las regiones hidrofóbicas se unen a la matriz; se eluyen reduciendo sales o cambiando disolvente.

• Se usan en la captura de proteínas basadas en hidrofobicidad, separación de formas post-translacionales.

Cuantificación total

• A₂₈₀ (absorbancia): estimación rápida si conoces el coeficiente de extinción (depende de Trp/Tyr). Rápido pero interferido por nucleótidos/compuestos.

• Ensayos colorimétricos:

Bradford (rápido, sensible)BCA (robusto ante detergentes). Elegir según compatibilidad con componentes del tampón.

• Técnica que usa corriente eléctrica para separar biomoléculas como proteínas y ácidos nucléicos en un medio poroso
• SDS-PAGE (desnaturalizante): separa por masa. Útil para pureza y masa aparente.

• Native-PAGE: mantiene estructura nativa/oligomerización.

• Western blot: detecta proteína mediante anticuerpos; imprescindible para confirmar identidad

Espectrometría de masas (MS, LC-MS/MS)

• Identificación de proteína (peptide-mapping), masas exactas, modificaciones postraduccionales (fosforilación, glicosilación), y cuantificación (label-free o etiquetado).
• Requiere digestión enzimática (ej. tripsina) y buena preparación de muestra

Conformación y estabilidad

CD (dicroísmo circular): contenido en estructura secundaria (hélice α vs lámina β) y monitorización de desnaturalización térmica. DSC / DSF (ensayo de fusión térmica): determina Tm y estabilidad térmica. DLS (luz dinámica): tamaño hidrodinámico y presencia de agregados. Analytical ultracentrifugation: oligomerización y masa molar en solución.

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2018). Principios de bioquímica (7.ª ed.). Ediciones Omega. Principios de bioquímica 7° ed… Ramírez-Carreto, S. (2021). Purificación de proteínas. Mensaje Bioquímico — Facultad de Medicina, UNAM. Recuperado de https://biosensor.facmed.unam.mx/mensajebioquimico/wp-content/uploads/2021/06/7-Rodriguez-Purificacion.pdf . Biosensores Sigma-Aldrich / Merck. (s. f.). Manual: Purificación de proteínas usando His GraviTrap / TALON (protocolo). Recuperado de https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/technical-documents/protocol/protein-biology/protein-purification/manual-purification-using-his-gravitrap-talon . MilliporeSigma