Genetica molecolare

Genetica

molecolare

I nucleotidi sono a loro volta composti da uno zucchero pentoso, il deossiribosio, al quale sono legati covalentemente un gruppo fosfato e una base azotata. Nel DNA si trovano quattro basi diverse: due ad anello singolo appartenenti alla classe delle pirimidine, la citosina (C) e la timina (T), e due ad anello doppio che appartengono alle purine, l’adenina (A) e la guanina (G).

DNA

Il DNA (acido deossiribonucleico) è un acido nucleico formato da due lunghe catene polinucleotidiche composte da 4 tipi di subunità dette nucleotidi.

DNA: struttura primaria

I nucleotidi sono uniti tra loro mediante legame fosfodiesterico, cioè un particolare tipo di legame covalente in cui un atomo di fosforo è legato ad altre 2 molecole tramite 2 legami esterei. In particolare, nella molecola di DNA esso collega l’atomo di carbonio in posizione 3’ dello zucchero di un nucleotide con il carbonio in 5’ del nucleotide successivo. Le basi azotate, invece, si uniscono in posizione 1' dello zucchero desossiribosio con legami N- glicosidici. Lo scheletro covalente del DNA è costituito da un’alternanza di gruppi fosforici e di residui di pentoso, mentre le basi azotate possono essere considerate come gruppi laterali uniti allo scheletro ad intervalli regolari.

Studi ai raggi X di ROSALIND FRANKLIN e MAURICE WILKINS sulla struttura elicoidale del DNA:

Utilizzando campioni di DNA molto purificati ottennero informazioni sulla struttura atomica del DNA. Questi studi conclusero che il DNA ha una struttura ad elica e presenta 2 periodicità di 0.34nm e 3.4 nm lungo l’asse della molecola.

DNA: struttura secondaria

Regola di CHARGAFF sulla composizione in basi: Chargaff idrolizzò il DNA mediante trattamento chimico e separò i nucleotidi mediante cromatografia su carta. I suoi esperimenti dimostrarono che il rapporto relativo delle 4 basi non era uguale, ma nemmeno casuale. In tutti i campioni di DNA analizzati, il numero di residui di adenina (A) era uguale a quello di timina (T), mentre il numero delle guanine (G) uguagliava quello delle citosine (C).

• A=T G=C
• Somma delle purine = somma delle pirimidine
• La percentuale di (A+T) non è necessariamente uguale alla percentuale di (G+C)

Modello di Watson e Crick (1953)

Watson e Crick proposero un modello spaziale della struttura del DNA che meglio di ogni altro ne spiega le proprietà chimico-fisiche e biologiche.

• 2 catene polinucleotidiche
• 2 catene sono disposte in maniera antiparallela
• doppia elica destrorsa
• Le basi dei filamenti opposti sono unite da legami idrogeno
• l’adenina si lega alla timina con 2 legami idrogeno e la guanina alla citosina con 3 legami
• A-T e G-C sono dette coppie di basi complementari

La maggior parte dei procarioti contiene un singolo cromosoma costituito da DNA a doppia elica circolare associato a proteine. Questo cromosoma è compattato nella cellula mediante il superavvolgimento dell’elica di DNA e la formazione di anse. Alcuni procarioti possiedono un cromosoma principale ed uno o più cromosomi (lineari o circolari) più piccoli detti plasmidi.

Cromosomi dei procarioti

L’organizzazione del DNA nei cromosomi

Il DNA di una cellula è organizzato in strutture fisiche chiamate cromosomi. Il cromosoma è un’entità dinamica la cui forma si modifica durante le fasi del ciclo cellulare: la forma più condensata si ha durante la metafase, quella meno condensata durante la trascrizione e la replicazione del DNA.

Gli eucarioti, invece, possiedono diversi cromosomi e in particolare il numero dei cromosomi è specie-specifico. Ogni cromosoma è costituito da un complesso di una molecola lineare di DNA e di proteine noto come cromatina. Esistono 2 tipi di proteine associate al DNA che determinano la struttura del cromosoma e sono: • gli istoni: sono piccole proteine basiche ricche di arginina e lisina (AA carichi positivamente) che legano il DNA carico negativamente. • proteine non istoniche: sono spesso proteine acide con carica netta negativa che si legano agli istoni carichi positivamente.

Cromosomi degli eucarioti

Le unità strutturali e funzionali della cromatina sono i nucleosomi costituiti da un core formato 8 proteine istoniche e dal DNA avvolto intorno ad esso. Il DNA che lega ciascun nucleosoma è detto DNA linker. Questo tipo di organizzazione conferisce al DNA una morfologia a filo di perle che permette di ridurre l’ingombro del DNA di 6-7 volte. Vi è poi un secondo livello di compattamento dovuto all’istone H1 che si lega sia al DNA linker sia al centro della sequenza avvolta intorno al nucleo di istoni. In questo modo i nucleosomi si compattano in una struttura dal diametro di 30nm. La fibra cromatinica da 30nm si ripiega ulteriormente in una struttura ad anse producendo un cromosoma di circa 10000volte più corto e 400 volte più spesso del filamento nudo di DNA.

Cromosomi degli eucarioti

Il grado di condensazione della cromatina varia durante il ciclo cellulare: il DNA è più rilassato quando è in procinto di replicarsi, mentre raggiunge la massima condensazione durante la mitosi e la meiosi. • Eucromatina: cromatina meno condensata che è generalmente costituita dalle regioni attive del genoma (in cui vi è un'intensa attività di trascrizione) e si condensa solo durante la mitosi e la meiosi. • Eterocromatina: cromatina molto condensata che è costituita dalle regioni inattive del genoma. Tutti i cromosomi hanno 2 regioni specializzate: • Centromero: regione responsabile della precisa segregazione dei cromosomi durante la mitosi e la meiosi e che tiene insieme i cromatidi fratelli. • Telomero: sequenze eterocromatiche che si trovano nella regione terminale di un cromosoma. Sono formati da DNA altamente ripetuto che protegge l'estremità del cromosoma dal deterioramento.

Cromosomi degli eucarioti

Il grado di condensazione della cromatina varia durante il ciclo cellulare: il DNA è più rilassato quando è in procinto di replicarsi, mentre raggiunge la massima condensazione durante la mitosi e la meiosi. • Eucromatina: cromatina meno condensata che è generalmente costituita dalle regioni attive del genoma (in cui vi è un'intensa attività di trascrizione) e si condensa solo durante la mitosi e la meiosi. • Eterocromatina: cromatina molto condensata che è costituita dalle regioni inattive del genoma. Tutti i cromosomi hanno 2 regioni specializzate: • Centromero: regione responsabile della precisa segregazione dei cromosomi durante la mitosi e la meiosi e che tiene insieme i cromatidi fratelli. • Telomero: sequenze eterocromatiche che si trovano nella regione terminale di un cromosoma. Sono formati da DNA altamente ripetuto che protegge l'estremità del cromosoma dal deterioramento.

I geni

I geni sono le unità fisiche e funzionali dell’eredità, che trasportano l’informazione da una generazione alla successiva. In termini molecolari il gene è l’intera sequenza di DNA necessaria alla produzione di una proteina funzionante o di un RNA.

• Esoni: contengono la sequenza codificante per la proteina
• Introni: porzioni del gene che interrompono gli esoni e non codificano per la proteina. Costituiscono la maggior parte del gene.
• Promotore: regione a monte della sequenza codificante a cui si legano i fattori di trascrizione.
• Enhancers: a monte o a valle del gene che potenziano l’azione dei promotori.

Il gene eucariotico contiene:

I geni

Il gene procariotico contiene:

• Promotore: a monte della sequenza codificante a cui si legano i fattori di trascrizione e di repressione.​
• Regioni non codificanti: a monte e a valle della regione codificante che contengono i siti di attacco dei ribosomi e i segnali di terminazione della trascrizione.​
• Regione codificante: contiene l’informazione per la proteina.

RNA: struttura

L’RNA (acido ribonucleico) è un acido nucleico che presenta una struttura simile a quella del DNA: le differenze nella loro struttura sono poche ma sostanziali.

• Lo zucchero pentoso presente è il ribosio (presenza di un gruppo idrossile in posizione 2')
• Presenta l’uracile (U) che sostituisce la timina (T) del DNA.
• Solitamente è a singola catena polinucleotidica: non esiste una corrispondenza tra le percentuali delle basi complementari (non segue le regole di Chargaff)
• La struttura della catena polinucleotidica che nell’RNA, salvo alcune rare eccezioni, presenta un filamento singolo ed è di gran lunga più svariata di quella del DNA. Il singolo filamento di RNA può ripiegarsi, in modo che sequenze complementari di basi formano uno stelo (steem) con un’ansa a singolo filamento (loop), generando alcuni tratti a doppia elica con una struttura a stelo e ansa.

Tutti gli aminoacidi, tranne la glicina, hanno l’atomo di carbonio ha legato a 4 gruppi diversi:

• un atomo di idrogeno,
• un gruppo aminico (–NH2),
• un gruppo carbossilico (–COOH),
• una catena laterale detta gruppo R. Nella glicina il gruppo R è un atomo di idrogeno.

Gli aminoacidi differiscono l’uno dall’altro per la catena laterale che può avere struttura, carica o dimensioni diverse e influenza la solubilità dell’aminoacido in acqua. I gruppi R possono essere non polari e idrofobici, aromatici e polari non carichi o carichi.

Proteine

Sono composti organici azotati ad alto peso molecolare e sono tutte costituite dallo stesso gruppo di 20 aminoacidi legati tra loro in modo covalente attraverso il legame peptidico. Questi 20 aminoacidi sono detti primari o standard.

la struttura secondaria è la disposizione nello spazio dei residui aminoacidici vicini. Le strutture secondarie sono ripetitive, stabilizzate da legami a idrogeno e possono essere strutture a α-elica o foglietti-β.

• Le α-eliche sono strutture elicoidali in cui lo scheletro peptidico è strettamente arrotolato intorno ad un asse immaginario.
• Nei foglietti-β lo scheletro covalente è esteso con un andamento a zig-zag.

Struttura secondaria

Proteine

Struttura primaria

La struttura primaria di una proteina è la sequenza degli aminoacidi nella catena peptidica. Gli aminoacidi sono tenuti insieme dal legame peptidico. Le singole unità aminoacidiche presenti in un peptide vengono dette residui. I residui con cui inizia la catena hanno un gruppo amminico α libero (N-terminale), mentre i residui con cui finisce la catena hanno un gruppo carbossilico α libero (C-terminale).

Le proteine hanno anche una struttura terziaria data dal ripiegamento tridimensionale del polipeptide. In questo caso entrano in contatto anche residui aminoacidici molto lontani nella sequenza primaria della proteina e la struttura è stabilizzata da legami idrogeno, ionici, covalenti e da interazioni idrofobiche.

Struttura secondaria

Proteine

Struttura terziaria

Le proteine hanno anche una struttura terziaria data dal ripiegamento tridimensionale del polipeptide. In questo caso entrano in contatto anche residui aminoacidici molto lontani nella sequenza primaria della proteina e la struttura è stabilizzata da legami idrogeno, ionici, covalenti e da interazioni idrofobiche.

La replicazione è un meccanismo molecolare attraverso il quale viene prodotta una copia del DNA cellulare per far sì che l’informazione genetica codificata nei nucleotidi possa essere trasmessa da ciascuna cellula alla sua progenie in maniera fedele. Sia nei procarioti che negli eucarioti questo processo avviene con un meccanismo semiconservativo (Meselson e Stahl 1957). I filamenti di una doppia elica di DNA si separano ed un nuovo filamento di DNA complementare viene sintetizzato su ciascuno dei due filamenti stampo parentali. Vengono prodotte due molecole di DNA a doppia elica, ciascuna delle quali ha un’elica parentale e una di nuova sintesi.

Replicazione del DNA

Le principali proteine coinvolte nel processo di duplicazione del DNA sono:

DNA polimerasi

sintetizza il DNA in direzione 5’-3’ catalizzando la formazione del legame fosfodiesterico tra i nucleotidi. Questo enzima non può iniziare la sintesi di un nuovo filamento di DNA, ma può solo aggiungere nucleotidi ad un filamento preesistente.

DNA primasi

sintetizza un corto filamento di RNA primer (5-10b) al quale possono essere aggiunti nuovi nucleotidi dalla DNA polimerasi.

DNA elicasi

srotola il DNA.

DNA ligasi

unisce frammenti di DNA neosintetizzati.

SSB

proteine che legano il DNA a singolo filamento e ne impediscono il riavvolgimento.

Replicazione del DNA: inizio

La replicazione inizia in una particolare regione del DNA detta origine di replicazione (ori). I cromosomi circolari dei procarioti contengono una sola origine, mentre i lunghissimi cromosomi lineari degli eucarioti possiedono origini multiple. Nelle primissime fasi della replicazione, la regione di DNA che contiene l’origine di replicazione viene denaturata formando la bolla di replicazione. A questo punto le DNA elicasi iniziano a srotolare il DNA in entrambe le direzioni a partire dall’origine di replicazione. Successivamente la DNA elicasi richiama ed attiva l’enzima DNA primasi che sintetizza un corto filamento di RNA primer (5-10bp) al quale possono essere aggiunti nuovi nucleotidi dalla DNA polimerasi. Questi primer verranno poi rimossi.

Replicazione del DNA: allungamento

Quando la sintesi del primer è terminata la DNA primasi si stacca e la DNA polimerasi si lega al primer neosintetizzato ed inizia a sintetizzare il nuovo filamento di DNA: accetta nel proprio sito catalitico un nucleotide libero, ma solo se la sua base azotata risulta complementare a quella corrispondente sullo stampo avviene la formazione del legame fosfodiesterico.

Replicazione del DNA: replicazione

La DNA polimerasi può sintetizzare il DNA solo in direzione 5’-3’, ma le due eliche del DNA hanno polarità opposta. Per questo motivo un’elica viene sintetizzata in maniera continua a partire da un solo primer a RNA ed è detta elica guida, mentre l’altra detta elica lenta, necessita di più primer a RNA e viene prodotta in maniera discontinua in più frammenti detti frammenti di Okazaki. Questi frammenti vengono successivamente uniti a formare un filamento continuo di DNA grazie alla DNA ligasi che catalizza la formazione del legame fosfodiesterico tra i due frammenti vicini. Dato che l’elica guida viene sintetizzata in modo continuo e quella lenta in maniera discontinua, la replicazione nel complesso è detta semidiscontinua.

Replicazione delle estremità dei cromosomi

Poiché i cromosomi eucariotici sono lineari e la DNA polimerasi può sintetizzare nuovo DNA solo estendendo un primer, la replicazione delle estremità dei cromosomi eucariotici avviene con un meccanismo diverso. Un cromosoma parentale viene replicato generando due nuove molecole di DNA, ciascuna delle quali ha un primer di RNA all’estremità 5’nella regione del telomero di ciascuna elica neosintetizzata. I primer vengono eliminati lasciando un tratto di DNA a singola elica che non può essere riempito dalla DNA polimerasi. Un enzima chiamato telomerasi mantiene la lunghezza dei cromosomi aggiungendo delle ripetizioni nucleotidiche alle estremità.

Il meccanismo di riparazione del DNA

Il complesso meccanismo della duplicazione del DNA non è perfetto e può compiere errori che possono essere corretti con 3 meccanismi diversi:

• Correzione di bozze: ogni volta che introduce un nuovo nucleotide la DNA polimerasi controlla se l’appaiamento è corretto. Se si accorge di un appaiamento sbagliato, toglie il nucleotide introdotto impropriamente e lo sostituisce.
• Riparazione dei disappaiamenti: al termine della duplicazione la molecola neosintetizzata viene riesaminata, se vengono rilevate anomalie le basi disappaiate vengono sostituite.
• Riparazione per escissione: elimina le basi anomale dovute a un agente chimico e le sostituisce con basi funzionali.

Il dogma centrale della biologia

Secondo il dogma centrale della biologia, in tutte le cellule, l’informazione passa in un solo senso, dai geni alle proteine. Per fare ciò le cellule possiedono dei meccanismi molecolari in grado di leggere le informazioni contenute nelle sequenze di basi del DNA e di trasformarle nelle sequenze di amminoacidi che formano le proteine. Ciò avviene grazie a due processi fondamentali.

1. La trascrizione consiste nella produzione di RNA a partire dal tratto di DNA corrispondente.
2. La traduzione consiste nella produzione di sequenze di amminoacidi a partire dal trascritto di RNA. I polimeri di amminoacidi costituiscono le catene polipeptidiche che formano le proteine.

Il dogma centrale ha una sola parziale eccezione che non riguarda però gli esseri viventi, ma i virus.

Trascrizione

La trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA.Dal punto di vista chimico la trascrizione del DNA è simile alla replicazione, ma in questo caso non è richiesta la presenza di primer per avviare la reazione di polimerizzazione. Durante la trascrizione una sola delle due catene che compongono la molecola di DNA, detta elica stampo, viene copiata in RNA in direzione 5’-3’. L’altra elica, invece, è detta elica senso perché avrà la stessa sequenza di basi della molecola di RNA neosintetizzata salvo per la presenza della timina al posto dell’uracile.

Durante questo processo un breve tratto di DNA vicino ad un’unità di trascrizione si svolge e una RNA polimerasi catalizza la sintesi di una molecola di RNA. Le cellule procarioti possiedono un unico tipo di RNA polimerasi capace di provvedere alla sintesi di tutti gli RNA necessari. Le cellule eucarioti, invece, possiedono 3 tipi diversi di RNA polimerasi ciascuno dei quali trascrive selettivamente diverse classi di geni.

Trascrizione: allungamento

Durante la fase di allungamento la RNA polimerasi legge le informazioni contenuto nello stampo di DNA e sintetizza la nuova molecola di mRNA. Man mano che la RNA polimerasi procede, srotola la doppia elica di DNA che la precede e riassocia l’elica alle sue spalle. All’interno della regione srotolata i nucleotidi dell’RNA sono appaiati con il DNA in un temporaneo ibrido DNA – RNA. La trascrizione procede “lentamente” ad una velocità di circa 50bp/s perché la RNA polimerasi ha 2 attività di correzione di errori attraverso le quali può rimuovere e sostituire uno o più nucleotidi inseriti scorrettamente.

Trascrizione: inizio

La trascrizione ha inizio quando l’enzima RNA polimerasi si attacca ad un punto preciso della molecola di DNA, detto promotore ed inizia a srotolarla. La regione di DNA denaturato forma una bolla di trascrizione. Per ciascun gene esiste un promotore, cioè una sequenza di basi che fornisce una serie di importanti informazioni quali il punto da cui iniziare la trascrizione, quale dei due filamenti del DNA deve essere trascritto e in quale direzione procedere.

Trascrizione: terminazione

La trascrizione termina quando l’RNA polimerasi incontra particolari sequenze dette terminatori. A questo punto, l’enzima si stacca dal DNA e dal filamento di RNA. Può avvenire con 2 meccanismi differenti. La terminazione RHO-dipendente richiede la presenza della proteina RHO che si lega alla sequenza terminatore sull’RNA, idrolizza ATP e utilizza l’energia prodotta per separare l’RNA dal DNA e dall’RNA polimerasi. La terminazione RHO-indipendente, invece, avviene ad opera della stessa RNA polimerasi che trascrive la sequenza del terminatore formata da una regione a simmetria ripartita (che una volta trascritta si ripiega a formare una forcina) seguita da una regione ricca di AT. Questo tipo di struttura favorisce il distacco della polimerasi.

Processamento dell’mRNA

Gli mRNA eucariotici sono generalmente modificati ad entrambe le estremità sia al 5’ che al 3’.

• Capping al 5’: aggiunta di un nucleotide guanina all’estremità 5’ e gli zuccheri di 2 nucleotidi successivi vengono metilati. Serve a proteggere l’mRNA maturo dalla degradazione da parte delle esonucleasi e nella prima fase della traduzione per l’attacco del ribosoma all’estremità 5’ dell’mRNA.
• Coda di poli(A): aggiunta di una sequenza di 50-250 adenine all’estremità 3’. Questa coda serve per il trasporto dell’RNA dal nucleo al citoplasma dove lo protegge anche dalla degradazione da parte di esonucleasi e lo stabilizza.

I geni eucariotici contengono sequenze che non codificano per aminoacidi dette introni e sequenze tradotte dette esoni. Lo splicing dell’mRNA è quel processo attraversi il quale vengono rimossi gli introni che devono essere assenti nell’mRNA maturo che avviene nel nucleo all’intero di particolari complessi chiamati spliceosomi.

Lo splicing alternativo è un processo cellulare mediante il quale un gene può dare origine a più di un tipo diverso di mRNA mediante un diverso arrangiamento degli esoni. Le diverse proteine formate sono dette isoforme. Lo splicing alternativo incrementa notevolmente il potenziale codificante di un genoma perché facilita la creazione/evoluzione di nuove proteine attraverso la diversa combinazione degli esoni. È stimato che il 90-95% dei geni umani va incontro a splicing alternativo. Numerosi fattori cellulari possono determinare quale variante di splicing (trascritto alternativo) sarà prodotto da quel determinato tessuto o cellula. Lo splicing alternativo è un processo regolato da proteine che riconoscono sequenze specifiche e possono trovarsi sia negli introni che negli esoni. Le sequenze che permettono il riconoscimento dei siti di splicing sono chiamate splicing enhancers, mentre le sequenze che mascherano tali siti sono chiamate splicing silencers.

Splicing alternativo

RNA editing

È un processo che prevede l’inserzione o la delezione post-trascrizionale di nucleotidi o la conversione di una base in un’altra. In questo modo la molecola di RNA funzionale non sarà collineare alla sequenza del DNA codificante. Esistono due meccanismi che mediano l’editing:

• La modificazione chimica dei nucleotidi per deamminazione (trasformazione dell'adenina in inosina o della citosina in uracile)
• L'inserzione o delezione di basi. In entrambi i casi, l'editing può portare cambiamenti radicali alla sequenza e al senso di lettura dell'mRNA, tanto che la proteina risultante dalla sintesi di un mRNA maturo può essere molto diversa, nella composizione in amminoacidi, da quella prevista dal codice genetico

Traduzione

La Traduzione (detta anche sintesi proteica) è il processo biochimico attraverso il quale l'informazione genetica contenuta nel mRNA (RNA messaggero), viene convertita in proteine. Il codice genetico è un codice a triplette, infatti, ogni amminoacido è codificato da una sequenza di 3 nucleotidi consecutivi detta codone Le basi dell'RNA sono quattro: adenina, guanina, citosina ed uracile. Esistono quindi = 64 codoni possibili. 61 di essi codificano gli amminoacidi, mentre i restanti tre (UAA, UAG, UGA) codificano segnali di stop (stabiliscono, cioè, a che punto deve interrompersi la catena polipeptidica). Poiché gli amminoacidi che concorrono alla formazione delle proteine sono 20 e i codoni 64, essi in generale sono codificati da più di un codone (con l'eccezione di triptofano e metionina) pertanto il codice genetico viene definito "degenere". Codoni distinti che codificano il medesimo amminoacido sono detti sinonimi.

• AUG è il codone di inizio in eucarioti e procarioti.
• 61 codoni codificano per aa e sono detti codoni senso
• UAG-UAA-UGA non codificano per aa e sono detti codoni di stop (non senso/terminazione)

Il codice genetico

• Le caratteristiche del codice genetico sono le seguenti:
• Il codice è a triplette: ogni codone dell’mRNA è di 3 nucleotidi.
• Il codice è letto in modo continuo 3 nucleotidi per volta senza segni di interpunzione.
• Il codice non ha sovrapposizioni: viene letto in gruppi successivi di 3 nucleotidi.
• Il codice è universale: tutti gli organismi condividono lo stesso codice. È possibile isolare l’mRNA di un organismo e tradurlo con il macchinario di un altro per produrre una proteina.
• Il codice è degenerato: un aa può essere codificato da più di un codone
• Il codice ha segnali di inizio e di terminazione:

Tutti i t RNA hanno una struttura a trifoglio in cui una sola elica di RNA è ripiegata a formare 4 anse. Una è detta ansa dell’aminoacido perché trasporta uno specifico aminoacido legato mediante un legame estere. Nel tRNA troviamo poi l’ansa dell’anticodone, l’ansa D e l’ansa TΨC. L’allineamento del tRNA all’mRNA è di tipo antiparallelo: la prima base del codone si appaia con la terza base dell’anticodone. Alcuni tRNA riconoscono più di un codone perché codoni diversi che codificano uno stesso aa spesso differiscono solo per la terza base. La terza base della maggior parte dei codoni si appaia in modo libero con la base corrispondente del codone: può vacillare. Mediante il vacillamento per tradurre 61 codoni viene utilizzato un set minimo di 32 t RNA.

tRNA

I tRNA sono lunghi 75-90b ed hanno il compito sia nei procarioti che negli eucarioti di portare gli aminoacidi al complesso m RNA- ribosoma. Il tRNA, infatti, funge da adattatore nella sintesi proteica in quanto presenta una sequenza complementare al codone dell’mRNA detta anticodone con la quale legge l’informazione codificata nell’mRNA e trasferisce l’opportuna alla catena polipeptidica nascente.

Traduzione: aminoacilazione

La prima fase della traduzione è sempre l’aminoacilazione in cui i 20 diversi AA vengono legati mediante legame estere al loro tRNA ad opera dell’enzima aminoacil tRNA sintetasi. Esistono 20 aminoacil tRNA sintetasi diverse ognuna specifica per un AA. Il processo di caricamento ricava energia dall’idrolisi di ATP e produce un aminoacil-tRNA carico.

Sia nei procarioti che negli eucarioti i ribosomi consistono in 2 subunità una grande e una piccola formate da rRNA e proteine ribosomiali. La subunità maggiore dei ribosomi possiede 3 siti di legame:

• il sito A che lega l’aminoacil-tRNA che porta l’AA da inserire nella cartena,
• il sito P occupato dal tRNA che porta la catena polipeptidica nascente
• il sito E che ospita i tRNA che hanno fornito l’AA prima che esano dal ribosoma.

Traduzione: inizio

La sintesi proteica ha luogo sui ribosomi nel citoplasma dove l’mRNA viene tradotto in direzione 5’-3’. Sia per i procarioti che per gli eucarioti il codone di inizio è sempre AUG e il polipeptide è sintetizzato dall’estremità N-terminale verso l’estremità C-terminale.

• Legame dell’aminoaciltRNA: nel primo passaggio l’amininoacil-tRNA si lega al sito A.
• Formazione del legame peptidico: a questo punto il ribosoma mantiene 2 aminoacil-tRNA nei siti P ed A e deve formarsi un legame peptidico tra i due AA. La formazione del legame peptidico prevede 2 fasi: la rottura del legame tra l’AA ed il tRNA nel sito P e la formazione del legame peptidico tra l’AA libero e quello legato al tRNA nel sito A grazie all’enzima peptidil- transferasi.
• Traslocazione del tRNA: il ribosoma si sposta di 3 basi verso l’estremità 3’dell’mRNA. Il tRNA che si trova sul sito A si sposta in P, mentre quello scarico in P viene spostato prima in E e poi rilasciato nel citosol. A questo punto il ribosoma è pronto per un altro ciclo di allungamento che continua finché la proteina non è completa.

Traduzione: allungamento

Traduzione: terminazione

La quarta fase della traduzione è la terminazione che è segnalata da uno dei 3 codoni di stop (UAG, UAA e UGA). I codoni di stop non codificano per alcuni aminoacidi e vengono riconosciuti da particolari proteine dette fattori di terminazione o rilascio. Quando uno dei codoni di stop occupa il sito A del ribosoma, si verifica il legame dei fattori di rilascio che provocano l’idrolisi del legame terminale del peptidiltRNA, il rilascio del polipeptide e la dissociazione delle subunità ribosomiale.

Trascrizione e traduzione: procarioti ed eucarioti

Nei procarioti il trascritto di RNA funziona direttamente come messaggero e poiché non esiste il nucleo un mRNA inizia ad essere tradotto prima che la sua trascrizione sia completata. Questo processo è detto accoppiamento della trascrizione e della traduzione. Gli mRNA vengono sintetizzati in direzione 5’-3’ e vengono tradotti nella stessa direzione. I ribosomi iniziano la traduzione dall’estremità 5’ prima cha la trascrizione sia stata completata. Negli eucarioti, invece, l’RNA trascritto deve essere modificato nel nucleo attraverso una serie di eventi noti come processamento dell’RNA per produrre un mRNA maturo. Inoltre, l’mRNA deve migrare dal nucleo al citoplasma dove sono localizzati i ribosomi prima di essere tradotto. Negli eucarioti, quindi, l’RNA prima di essere tradotto è sempre trascritto completamente.

Regolazione dell’espressione genica

La regolazione dell’espressione genica è il processo che permette ad una cellula di esprimere un determinato gruppo di geni in un contesto e di silenziarne altri.Nei procarioti la regolazione dell’espressione genica avviene a livello della trascrizione. I procarioti possiedono 2 classi di geni:

• geni regolati: geni la cui attività è controllata in risposta alle necessità della cellula
• geni costitutivi o housekeeping: geni i cui prodotti sono essenziali per il normale funzionamento della crescita e della divisione cellulare. Sono sempre attivi.

La trascrizione dei geni regolati è controllata da specifiche proteine di regolazione che possono agire come:

• Repressori: si legano al DNA bloccando la trascrizione del gene.
• Attivatori: facilitano l’attacco dell’RNA polimerasi al promotore e quindi la trascrizione del gene.

Operone inducibile

Operone reprimibile

Regolazione dell’espressione genica

Nei batteri, i geni che codificano per proteine coinvolte nello stesso processo di solito sono organizzati in un operone. Nell’operone i geni sono uno adiacente l’altro e vengono trascritti insieme in un mRNA chiamato poligenico o policistronico. La regolazione della sintesi di mRNA policistronici dipende dall’interazione di una proteina regolatrice ed un sito regolatore chiamato operatore, che si trova adiacente alla sequenza dei geni.

Regolazione dell’espressione genica: eucarioti

Salvo rare eccezioni (in C. eleggano) non vi sono operoni negli eucarioti e l’espressione genica è più complicata a causa dei compartimenti delle cellule e della necessità di generare numeri elevati e tipi diversi di cellule. Anche se differenziate, tutte le cellule dell’organismo contengono lo stesso numero e lo stesso tipo di geni: sono geneticamente uguali. Il differenziamento dipende dal fatto che ogni cellula esprime soltanto i geni che codificano per le proteine di cui ha bisogno. Negli eucarioti l’espressione genica è regolata a più livelli:

• Struttura del cromosoma: affinché un gene sia attivato, la cromatina deve essere alterata nella regione del promotore e questo processo di rimodellamento coinvolge numerose proteine.
• Trascrizione: la trascrizione è controllata da specifiche sequenze di DNA chiamate promotori (si trovano a monte del gene) ed enhancer (possono essere anche molto distanti dal gene) che legano particolari proteine regolatrici dette attivatori che aumentano il livello della trascrizione. Esistono poi dei repressori che contrastano l’azione degli attivatori con conseguente blocco della trascrizione. La trascrizione viene controllata anche attraverso la modificazione chimica del DNA (la metilazione del DNA altera l'accessibilità fisica al genoma da parte del macchinario trascrizionale).

Regolazione dell’espressione genica: eucarioti

• Maturazione dell’mRNA: la cellula può effettuare una maturazione selettiva degli RNA precursori. Solo gli mRNA modificati saranno capaci di migrare nel citoplasma dove verranno tradotti, mentre gli mRNA non maturi resteranno nel nucleo e saranno poi degradati. Attraverso lo splicing alternativo, la cellula può formare mRNA diversificati dai quali si origineranno proteine differenti.
• Traduzione: è possibile impedire temporaneamente che l’mRNA si attacchi ai ribosomi, modificando chimicamente la configurazione della sequenza di inizio della traduzione. Un altro metodo richiede la presenza di una proteina che viene chiamata repressore della traduzione, la quale si lega all’mRNA impedendo il legame del ribosoma quando la proteina da esso codificata è già presente nel citoplasma in quantità sufficiente.
• Post-traduzionale: l’azione della proteina viene limitata attraverso la sua degradazione o apportando modifiche chimiche alla sua struttura in modo da alterarne la funzionalità.

notarangelo vittoria

Naderi melika

Grazie per l'attenzione!

Ne è un esempio l’operone del triptofano di E. Coli. Questo operone codifica gli enzimi deputati alla sintesi dell’amminoacido triptofano. Quando il triptofano è assente l’operone è attivo e i geni necessari per la biosintesi dell’amminoacido vengono trascritti. Quando il triptofano è presente nel terreno di cultura, gli enzimi che lo sintetizzano non sono più necessari. Il triptofano stesso agisce da corepressore, legandosi al repressore attivandolo. In questo modo viene bloccata la trascrizione.

Operone reprimibile

normalmente sono espressi perché il repressore è inattivo e viene attivato dal legame con un’altra sostanza detta corepressore. Il complesso repressore-corepressore si lega all’operatore, impedendo all’RNA polimerasi di trascrivere i geni dell’operone.

Ne è un esempio l’operone Lac di E. Coli. Il batterio E. Coli è capace di crescere in un terreno minimo che contiene sali e una fonte di carbonio come il glucosio. Gli enzimi richiesti per il metabolismo del glucosio sono codificati da geni costitutivi. Se ad E. Coli viene fornito come fonte di carbonio il lattosio, invece del glucosio, vengono sintetizzati 3 enzimi necessari per metabolizzare questo particolare zucchero. Questi enzimi sono codificati in un operone e sono inattivi se lo zucchero è assente. Sono geni regolati. Quando E.Coli cresce in presenza di lattosio, parte del lattosio si lega al repressore bloccandolo. In assenza del repressore l’RNA polimerasi si lega al promotore e i 3 geni sono trascritti in un'unica molecola di mRNA policistronico.

Operone inducibile

normalmente non è espresso perché il repressore è legato al sito operatore e impedisce l’attacco dell’RNA polimerasi. In condizioni particolari una sostanza detta induttore si lega al repressore facendolo staccare dal sito operatore, permettendo all’RNA polimerasi di iniziare la trascrizione.