Biotecnologie: pharming

Carraro Giulia Gregianin Leonardo Mercanzin Giovanni Wang Qi An

pharming

le nuove frontiere della biotecnologia

PHARMACEUTICALS FARMING

indice

5. tecnologia del DNA ricombinante

6. amtitrombina: come agisce

4. Coagulazione

3. pharming nelle piante

2. pharming negli animali

1. cos'e' il pharming

• In questa nuova branca della biotecnologia piante o animali sono geneticamente modificati per produrre proteine a scopo farmaceutico.
• E' sfruttata la tecnica del DNA ricombinante per introdurre geni (transgeni) che codificano proteine di interesse farmacologico nel DNA di animali di allevamento o di piante facilmente coltivabili.

• In questo modo l'organismo OGM diventa produttore della "proteina-farmaco" codificata dal transgene.
• Esistono oggi in commercio circa 200 biofarmaci (400 in via di sviluppo) prodotti con le tecniche dell’ingegneria genetica.

pharming

"con il termine Pharming si indica l’uso di animali o vegetali transgenici per la produzione di farmaci"

• Sintesi mirata:

L'espressione di un gene (sintesi della proteina corrispondente) è regolata da una sequenza di DNA (promotore) che si trova a monte del gene stesso. È questa sequenza che determina quando e in quale parte dell’organismo la proteina deve essere prodotta. Scegliendo un promotore opportuno, è possibile fare esprimere il transgene che codifica il biofarmaco in organi precisi dell’animale o della pianta nel quale il transgene è stato introdotto.

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"con il termine Pharming si indica l’uso di animali o vegetali transgenici per la produzione di farmaci"

• Nel pharming animale vengono scelti solitamente mammiferi e i transgeni sono corredati di un promotore che fa produrre il biofarmaco esclusivamente nelle ghiandole mammarie dell’animale.
• Il biofarmaco può poi essere facilmente purificato dal latte dell’animale transgenico, che diventa così un reattore vivente a ciclo continuo per tutta la sua vita produttiva.

• Per produzioni su larga scala vengono scelti i grandi mammiferi, come vacche o capre, mentre per alcuni scopi specifici vengono preferiti animali più piccoli come i conigli.

• Alcuni prodotti del pharming negli animali sono l'eritropoietina per l'anemia, i fattori di coagulazione del sangue VIII e IX per l'emofilia e l'alfa-1-antitripsina per l'enfisema e la fibrosi cistica.

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1) Animali

il rischio di danneggiare l'animale è limitato poichè la ghiandola mammaria non fa parte dei principali sistemi di supporto vitale

è possibile ottenere grandi quantità di proteina codificata da un transgene attraverso la mungitura

si possono far riprodurre facilmente e sono facili da mantenere

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2) Animali: vantaggi

• solo l' 1% delle cellule uovo iniettate porterà alla nascita di un individuo contenente il transgene e non tutti lo esprimeranno in modo accettabile

• il costo oltre ad essere elevato in vite animali è elevato anche in termini economici

è possibile che un transgene venga attivato in luoghi diversi dalla ghiandola mammaria e la proteina risultante potrebbe essere tossica per l'animale

Potenziale causa di sofferenza per gli animali:

• i geni non sono sempre espressi nei tessuti desiderati a causa dell'azione non mirata del DNA microiniettato

• il DNA inserito nell'ovulo fecondato può inserirsi nel genoma in modo da interronpere la normale funzione genica dell'animale difetti alla nascita, scarso sviluppo cerebrale, cancro, artrite, diabete o altri problemi di salute.

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3) Animali: limiti etici

1. Usare i virus per colpire il punto del genoma in cui sono inseriti i geni. I "retrovirus" inseriscono il loro materiale genetico nel genoma della cellula in modo prevedibile, prendendo di mira sequenze specifiche che in genere non interrompono le normali funzioni di una cellula. Non e' da escludere la possibilità che nuovi virus vengano creati e diffusi quando i componenti virali del transgene si combinano con virus naturali che potrebbero essere presenti in un organismo.
2. Sviluppare metodi di screening più potenti per stabilire se il transgene funziona correttamente nell'embrione prima che venga impiantato nell'utero.

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4) Animali: come ridurre i rischi

I primi esempi di sintesi nelle piante come bioreattori per la produzione di biofarmaceutici risalgono alla fine degli anni ’80, quando fu dimostrata la possibilità di esprimere anticorpi completi in foglie di tabacco e l’albumina sierica umana prodotta in tabacco e patata.

• É noto da secoli che le piante rappresentano la più importante fabbrica naturale di composti ad azione farmacologica su cui sono ancora fondate le medicine tradizionali cinese o indiana.

• La capacità delle cellule vegetali di sintetizzare, elaborare e indirizzare proteine complesse normalmente prodotte in cellule animali le rende un sistema alternativo efficiente per l'espressione di molecole di rilevanza farmacologica.

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5) Piante

• I biofarmaci realizzati con l'ausilio delle biotecnologie hanno un costo base piuttosto alto, determinato dalle condizioni di sintesi, di allevamento e di estrazione della molecola prodotta.
• Le piante rappresentano un’alternativa economicamente rilevante, rispetto a sistemi tradizionali basati su colture cellulari, per la produzione a basso costo di queste molecole: a partire da luce e semplici nutrienti si ottengono complesse molecole ricombinanti, competitive rispetto a sistemi tradizionali.

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6) Piante: vantaggi

• Le proteine biofarmaceutiche possono essere accumulate:

1. nelle foglie e nei frutti (tabacco, pomodoro, erba medica)
2. nei tuberi (patate)
3. nei semi (riso, frumento, mais, piselli e soia)

• Il primo biofarmaco prodotto in vegetali è stato approvato per uso farmaceutico negli Stati Uniti nel 2012: si tratta della taliglucerasi-alfa, un enzima usato nel trattamento della sindrome di Gaucher di tipo uno (grave malattia ereditaria che causa accumulo di grassi nel fegato, nella milza e in altri organi). Questo biofarmaco, tuttavia, è stato prodotto in cellule di carota coltivate in vitro, anziché nell’intera pianta, e non si tratta quindi di vero pharming.

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7) Piante: biofarmaci prodotti

https://cordis.europa.eu/article/id/25266-emea-blocks-use-of-first-transgenic-drug/it

https://cordis.europa.eu/article/id/25759-first-transgenic-drug-approved/it

Approvato il primo farmaco transgenico

06/06/2006

24/02/2006

Antitrombina

l'EMEA blocca l'utilizzo del primo farmaco transgenico

Il Comitato per i medicinali ad uso umano (CHMP), appartenente all'Agenzia europea per i medicinali (EMEA), ha espresso parere negativo sul farmaco Atryn, il primo medicinale prodotto grazie alla tecnologia transgenica di cui era stata richiesta l'approvazione per l'ingresso sul mercato negli Stati Uniti o in Europa.

Nonostante una falsa partenza in febbraio, il Comitato per i medicinali ad uso umano (CHMP), appartenente all'Agenzia europea per i medicinali, ha autorizzato l'impiego nell'UE del primo medicinale prodotto grazie alla tecnologia transgenica. Il farmaco, derivato da capre transgeniche, servirà a curare le persone prive di un gene necessario ad eliminare i trombi.

retrazione del coagulo

fibrinolisi

emostasi secondaria

emostasi primaria

danno endoteliale

La coagulazione del sangue è il fenomeno che determina, attraverso fasi successive e con l'intervento di numerose sostanze chimiche (fattori della coagulazione) attivate a cascata, la formazione di un reticolo insolubile di fibrina o 'coagulo' (dal latino cogere, co-agere, "stringere insieme").La coagulazione avviene in 5 fasi:

coagulazione

trasformazione batterica

plasmide ricombinante

selezione dei batteri trasformati

clonaggio

vettore di clonaggio

isolamento del gene

Per DNA ricombinante si intende una sequenza di DNA ottenuta artificialmente dalla combinazione di materiale genetico di origini differenti, come può avvenire per un plasmide contenente un gene d'interesse. Si usa anche definire proteina ricombinante ogni proteina ottenuta da trascrizione e traduzione di un frammento di DNA ricombinante inserito all'interno di un organismo ospite, che diviene in questo modo geneticamente modificato.

DNA ricombinante

L'antitrombina alfa è una forma ricombinata dell'antitrombina umana, estratta dal latte di capre transgeniche.

antitrombina

L'antitrombina si inserisce nella modulazione della coagulazione sanguigna, inibendo l'azione di fattori attivati della coagulazione, inclusi la trombina e i fattori Xa, IXa e XIa così da rallentare il processo e prevenire l'eccessiva e inappropriata formazione di coaguli (trombosi).

antitrombina

estrazione della proteina

selezione degli individui

impianto del DNA

modificazioni al DNA

Dopo aver selezionato il batterio trasformato contente il gene, questo viene fatto replicare, terminando il processo del clonaggio di un gene.

Il tappo piastrinico non è in grado di ostruire la lesione per il tempo necessario alla ricostituzione dell’integrità delle pareti del vaso.Questa fase è caratterizzata dalla stabilizzazione dell'aggregato, grazie all'attivazione della fibrina che avviene tramite due vie:

• via intrinseca
• vie estrinseca

La fibrinolisi è operata dal sistema della plasmina, ovvero la forma attiva del plasminogeno. Questo fattore anticoagulante viene attivato dalla trombina, la stessa che attiva proprio la fibrina. Il significato di questo accoppiamento di reazioni ad effetto biologico opposto è quello di garantire a una rapida formazione di un trombo, un'altrettanto rapida eliminazione (in proporzione alle dimensioni dello stesso).

Soluzione: il sito polylinker fa parte del gene reporter la cui espressione produce un fenotipo osservabile dall'esterno. Tramite il legame del gene di interesse a livello di un sito bersaglio di una endonucleasi, non è più possibile l'espressione del gene reporter. Si possono quindi distinguere i batteri trasformati contenti il gene da clonare osservando l'assenza del fenotipo.

Soluzione: i plasmidi utilizzati sono caratterizzati da un gene per la resistenza ad uno o più antibiotici. Facendo entrare in contatto la colonia batterica con un antibiotico, a cui i batteri trasformati sono resistenti, è possibile eliminare quelli non trasformati.

Problema 2: non tutti i plasmidi contengono il gene d'interesse (plasmidi ricombinanti) e quindi non sono utili alla clonazione di quest'ultimo.

Problema 1: non tutti i batteri si trasformano e quindi non conterrano il plasmide.

Il primo passaggio del clonaggio è l'isolamento del frammento di DNA da clonare.Sono necessarie le endonucleasi, enzimi in grado di idrolizzare i legami fosfodiesterei tra due nucleotidi adiacenti di una doppia elica di DNA. Queste proteine sono specifiche, agiscono su determinate sequenze di oligonucleotidi dette sequenze bersaglio. A livello delle sequenze bersaglio si formano estremità coesive o "piatte".Estremità coesive complementari tendono a legarsi tra loro tramite legami idrogeno.

A seguito del danneggiamento dell'interno del vaso, le cellule di quest'ultimo rilasciano endoteline, fattori che determinano la vasocostrizione delle arteriole.In questo modo sono limitate possibili emorragie.

Il vettore di clonaggio e il gene d'interesse, tagliati con la stessa endonucleasi, possiedono estremità coesive complementari. E' quindi probabile che si leghino spontaneamente.Il legame che si instaura tra gene e vettore è intermolecolare, quindi relativamente debole.La DNA ligasi è un enzima in grado di reinstaurare i legami fosfodierici tra due necleotidi adiacenti con il dispendio di ATP.

• Durante l'emostasi primaria le cellule endoteliali, a causa della lesione, secernono il fattore di von Willebrand (vWF).
• Le piastrine vi si legano tramite la glicoproteina Ib (GpIb) e a sua volta il fattore di von Willebrand si associa al collagene della matrice extracellulare.
• Le piastrine iniziano ad aderire al fattore di von Willebrand e cambiano forma, da discoidale a piatta, aumentando la loro superficie grazie alla stimolazione da parte di ADP.
• Le piastrine secernano ADP e TROMBOSSANO A2, con l’effetto di richiamare altre piastrine.
• Si viene a formare un primo "tappo" chiamato trombo bianco.

Nella clonazione, il vettore di clonaggio è linearizzato mediante l'enzima di restrizione usato per selezionare il gene in precedenza.

I vettori più utilizzati sono i plasmidi, ossia elementi genici circolari di piccole dimensioni, quindi facilmente distinguibile dal cromosoma batterico.

• un'origine di replicazione (ORI)
• un sito polylinker
• uno o più geni per la resistenza ad antibiotici
• un gene reporter

I vettori di clonaggio sono elementi genici caratterizzati da:

Ogni batterio contiene plasmidi, che vengono rilasciati a seguito della morte.La trasformazione è un processo in cui un batterio ingloba plasmidi liberi. Solo alcune specie batteriche possono acquisire DNA estraneo dall'ambiente, queste sono dette batteri naturalmente competenti. Quaesta competenza può essere indotta in laboratorio tramite alterazioni chimiche, elettriche e termiche. Facendo entrare in contatto batteri e plasmidi ricombinanti, è possibile che i primi inglobino i secondi per trasformazione.