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Microscopía de fluorescencia

Alejandra Hernandez Mendoza

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Información general

Introdución

La microscopía de fluorescencia es capaz de obtener imágenes de la distribución de una sola especie molecular basada únicamente en las propiedades de la emisión de fluorescencia.

Inicios DE LA microscopía de Fluorescencia

Los físicos alemanes Otto Heimstaedt y Heinrich Lehmann desarrollaron los primeros microscopios de fluorescencia a principios del siglo XX como un derivado del instrumento ultravioleta. Emplearon estos microscopios para observar la autofluorescencia en tejidos de bacterias, animales y plantas (1900).

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Microscopia de fluorescencia

Un microscopio de fluorescencia es una herramienta especializada diseñada para observar muestras que emiten luz fluorescente bajo la excitación de ciertas longitudes de onda. Mientras que un microscopio convencional utiliza luz visible, que está entre los 400 y 700 nanómetros para iluminar y magnificar la imagen de una muestra, el microscopio de fluorescencia, por otro lado, usa una intensidad de la luz mucho mayor, la cual excita las especies marcadas con fluorescencia en la muestra. Estas especies emiten a su vez, una luz de menor energía, con una longitud de onda mayor que reproduce la imagen magnificada, en vez de la fuente de luz original.

Conceptos básicos

La fluorescencia es la propiedad de algunos átomos y moléculas de absorber radiación en una longitud de onda particular y posteriormente emitir luz en una longitud de onda más larga tras la excitación de los átomos.

Moléculas fluorescentes naturales o sintéticas que marcan estructuras específicas (como proteínas, ácidos nucleicos).

Fluorescencia

Fluoróforos

Partes de Un miscroscopio de fluorescencias

Sus componentes principales se agrupan en sistemas ópticos, de iluminación y de detección.

Fuente de luzLámpara de mercurio o xenón: Genera una luz intensa en el rango ultravioleta y visible. LEDs de alta potencia: Alternativa más moderna, con mayor durabilidad y control.

Filtros ópticos

Filtro de excitación Espejo dicroico Filtro de emisión

Sistema óptico Objetivo: Lentes especializadas que recogen la luz fluorescente emitida por la muestra. Oculares: Permiten la observación directa de la imagen aumentada. Tubo óptico: Conduce la luz entre la muestra y el ocular o detector.

Muestra y soporte Portamuestras: Sostiene la muestra (generalmente preparada en portaobjetos). Platina: Plataforma ajustable para mover la muestra en los ejes X e Y.

Sistema de detección Cámara digital: Captura imágenes de la fluorescencia emitida. Detector fotomultiplicador (PMT): Sensores para microscopía confocal o análisis más sensible.

Sistema de control Computadora: Controla el sistema de iluminación, captura de imágenes y análisis. Software especializado: Permite procesar y analizar imágenes de fluorescencia.

Principio fundamental

El principio fundamental detrás de los microscopios fluorescentes es el uso de tintes/sustancias fluorescentes, también llamados fluoróforos, para marcar las estructuras celulares de interés. La luz con alta energía y longitud de onda corta se genera a partir de lámparas de arco de vapor de mercurio y pasa a través de un filtro de excitación que además permite que pase solo la longitud de onda corta de la luz, eliminando todas las demás longitudes de onda de luz no específicas. Se utiliza un filtro dicroico para reflejar la luz filtrada que incide sobre la muestra marcada con fluoróforo. El fluoróforo absorbe radiaciones de longitud de onda más corta y emite radiaciones de longitud de onda más larga que pasan a través del filtro de emisión. El filtro de emisión permite que la radiación de longitud de onda deseada llegue al detector, bloqueando cualquier otra luz de excitación residual. De esta manera, el microscopio fluorescente genera imágenes en color de las muestras marcadas con fluoróforos sobre un fondo oscuro

Son filtros especializados diseñados para reflejar las longitudes de onda de excitación y dejar pasar las de emisión eficientemente. Los dicroicos se posicionan en el camino óptico después del filtro de excitación pero antes del de emisión, a un ángulo de 45 grados respecto de cada uno de ellos

Espejos dicroicos

Están diseñados para suprimir o bloquear (absorber) las longitudes de onda de excitación en el paso hacia el detector.

Filtros de barrera o filtros de emisión

Filtros de excitación

Permiten que sólo las longitudes de onda seleccionadas de la fuente de luz pasen a través del camino de iluminación del espécimen

Los filtros juegan un papel muy importante en un Microscopio de Fluorescencia ya que son los que permiten separar la luz emitida de la luz de excitación.

Filtros para Fluorescencia

aPLICACIONES EN bIOLOGÍA cELULAR

La microscopia de fluorescencia es fundamental en biología celular para estudiar lozalización y dinámica de proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares Investigación en enfermedades: Cáncer: Identificación de biomarcadores. Neurociencias: Seguimiento de señales neuronales.

1. Fotoblanqueo (Photobleaching): Los fluoróforos pueden degradarse tras exposición prolongada a la luz, lo que reduce la intensidad de la señal.
2. Fototoxicidad: La luz intensa puede dañar las células vivas, afectando su comportamiento o incluso causándoles la muerte.
3. Resolución limitada : Aunque es superior a la microscopía de campo claro, la resolución sigue estando limitada por la longitud de onda de la luz en técnicas básicas.
4. Artefactos: La unión de fluoróforos a las moléculas de interés puede alterar su comportamiento natural.
5. Costo elevado: Los microscopios de fluorescencia y los reactivos asociados (fluoróforos, anticuerpos) suelen ser caros.
6. Fondo no deseado: La autofluorescencia de las muestras puede interferir con la señal deseada, reduciendo la relación señal-ruido.

Desventajas

Ventajas

microscopía de fluorescencia

1. Especificidad: Permite la visualización de moléculas específicas mediante fluoróforos que se unen a proteínas, ácidos nucleicos u otras moléculas de interés.
2. Alta sensibilidad: Detecta señales fluorescentes incluso a concentraciones muy bajas.
3. Resolución mejorada: Técnicas avanzadas como la microscopía de superresolución (STED, PALM, STORM) permiten observar estructuras más allá del límite de difracción de la luz convencional.
4. Versatilidad: Se puede combinar con múltiples fluoróforos para estudiar diferentes moléculas o procesos al mismo tiempo (multicolor).
5. Dinámica en tiempo real: Permite observar procesos celulares en vivo, como el transporte intracelular, la división celular o la señalización molecular.

1. Fluorescence Microscopy - Anatomy of the Fluorescence Microscope | Olympus LS. (s. f.). https://www.olympus-lifescience.com/es/microscope-resource/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy/
2. Microscopía de fluorescencia. (s. f.). Aplicaciones | Leica Microsystems. https://www.leica-microsystems.com/es/aplicaciones/tecnicas-basicas-de-microscopia/microscopia-de-fluorescencia/
3. http://users.df.uba.ar/catalina/TBM/TBM_labo3.pdf
4. Así funciona un microscopio de fluorescencia – Cromtek. (2022, 4 abril). https://www.cromtek.cl/2021/01/12/asi-funciona-un-microscopio-de-fluorescencia/

referencias

PIN: 570 5279

Kahoot!

La comunicación visual interactiva paso a paso:

• Planificar la estructura de tu comunicación.
• Jerarquizarla y darle peso visual a lo principal.
• Definir mensajes secundarios con interactividad.
• Establecer un flujo a través del contenido.
• Medir los resultados.

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