EXAMEN TUTORAL 4

Tutora: Dra. María Castañeda Bueno

EXAMEN TUTORAL

Márquez Salinas Alejandro

Desarrollo de un nuevo modelo celular para el estudio del túbulo contorneado distal

La proteína más importante de esta región de la nefrona es el cotransportador de sodio-cloro (NCC)

Túbulo contorneado distal (DCT)

Se subdivide en dos segmentos:

• DCT temprano / DCT1
• DCT tardío / DCT2 (zona de transición con túbulo conector)

McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.

El DCT es la región de la nefrona localizada entre la mácula densa y el túbulo conector. Funciones:

• Reabsorción del 5-10% del NaCl filtrado
• Regulación de la secreción de K+
• Homeostasis del calcio y del magnesio

McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.

Células DCT1

Células DCT2

McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.

Células DCT1

Células DCT2

• Dada la importancia de la función de NCC, se han hecho grandes esfuerzos por comprender su regulación.
• Actualmente sabemos que su actividad se regula principalmente a través de tres mecanismos:
• Activación de cinasas
• Activación de fosfatasas
• Degradación de componentes de la vía

Castañeda-Bueno M, Ellison DH, Gamba G. Molecular mechanisms for the modulation of blood pressure and potassium homeostasis by the distal convoluted tubule. EMBO Mol Med. el 7 de febrero de 2022;14(2):e14273 Carbajal-ContrerasH, et al. Arginine vasopressin regulates the renal Na + -Cl – and Na + -K + -Cl – cotransporters through with-no-lysine kinase 4 and inhibitor 1

Regulación de NCC

¿Por qué no hay un modelo celular? ¿Se han hecho intentos antes?

• Dada la importancia de la función de NCC, se han hecho grandes esfuerzos por comprender su regulación.
• Actualmente sabemos que su actividad se regula principalmente a través de tres mecanismos:
• Activación de cinasas
• Activación de fosfatasas
• Degradación de componentes de la vía

Castañeda-Bueno M, Ellison DH, Gamba G. Molecular mechanisms for the modulation of blood pressure and potassium homeostasis by the distal convoluted tubule. EMBO Mol Med. el 7 de febrero de 2022;14(2):e14273 Carbajal-ContrerasH, et al. Arginine vasopressin regulates the renal Na + -Cl – and Na + -K + -Cl – cotransporters through with-no-lysine kinase 4 and inhibitor 1

Regulación de NCC

Organ-on-a-chip:

Tubuloides:

Transwell:

• Las células pierden los estímulos que mantenían en el tejido nativo, provocando una pérdida de expresión de proteínas específicas a lo largo del tiempo

• Se ha demostrado que los métodos de siembra y el tratamiento de los platos con matrices (colágeno/fibronectina) ayudan a retrasar la pérdida de marcadores

Pérdida del estado de diferenciación celular

OldeHanhofCJA,YousefYengejFA,RookmaakerMB,VerhaarMC,VanDerWijstJ, Hoenderop JG. Modeling Distal Convoluted Tubule (Patho)Physiology: An Overview of Past Developments and an Outlook Toward the Future. Tissue Eng Part C Methods. el 1 de marzo de 2021;27(3):200–12.

OldeHanhofCJA,YousefYengejFA,RookmaakerMB,VerhaarMC,VanDerWijstJ, Hoenderop JG. Modeling Distal Convoluted Tubule (Patho)Physiology: An Overview of Past Developments and an Outlook Toward the Future. Tissue Eng Part C Methods. el 1 de marzo de 2021;27(3):200–12.

• Las células pierden los estímulos que mantenían en el tejido nativo, provocando una pérdida de expresión de proteínas específicas a lo largo del tiempo

• Se ha demostrado que los métodos de siembra y el tratamiento de los platos con matrices (colágeno/fibronectina) ayudan a retrasar la pérdida de marcadores

¿Cómo mantener el estado diferenciado de estas células?

Organ-on-a-chip:

Tubuloides:

Transwell:

Pérdida del estado de diferenciación celular

• El inhibidor A8301 bloquea al receptor TGFβ-RI evitando estos efectos

• Se ha utilizado para el cultivo de tubuloides de riñón de células humanas.

Proliferación + transición epitelio-mesénquima

• La transición epitelio-mesénquima (EMT) es principalmente mediada por la unión de TGF-β a sus receptores

Bloqueo de la transición epitelio-mesénquima

DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.

• La activación de la vía genera un aumento de β-catenina, que se trasloca al núcleo para generar sus efectos

• El CHIR99021 inhibe de manera específica a GSK3β, aumentando la concentración de β-catenina

• Involucrada con aumento de la actividad mitótica, especificación celular, polarización, regeneración, etc.

Activación de la vía Wnt - β-catenina

Rim EY, Clevers H, Nusse R. The Wnt Pathway: From Signaling Mechanisms to Synthetic Modulators. Annual Review of Biochemistry [Internet]. 2022 Jun 21;91(1):571–98. Available from: http://dx.doi.org/10.1146/annurev-biochem-040320-103615

Generar un nuevo modelo celular diferenciado del DCT

• Generar una metodología que permita el enriquecimiento del cultivo con células del DCT
• Identificar el rol de las vía de TGF-β y de Wnt para el mantenimiento del estado diferenciado de las células del DCT
• Realizar la validación del modelo
• Generar una nueva línea celular con inmortalización inducible

Objetivos

El desarrollo de un modelo de cultivo celular diferenciado del DCT facilitará el estudio detallado de la regulación del NCC, lo cual permitirá ampliar nuestra comprensión de la fisiología renal y de los mecanismos subyacentes a la hipertensión arterial sistémica.

Justificación

Rosa 26

Lox P

Lox P

Receptor de toxina diftérica

+/Cre

PV - Ter

Guo J-K, Shi H, Koraishy F, Marlier A, Ding Z, Shan A, et al. The Terminator mouse is a diphtheria toxin–receptor knock-in mouse strain for rapid and efficient enrichment of desired cell lineages. Kidney International [Internet]. Elsevier BV; 2013 Nov;84(5):1041–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/ki.2013.202

• Células del DCT no expresan receptor de tóxina diftérica

Rosa 26

Lox P

Lox P

Receptor de toxina difética

Presencia de recombinasa Cre en células que sintetizan parvalbúmina

+/Cre

• Expresión de recombinasa Cre dependiente de promotor de parvalbúmina

Promotor de parvalbúmina

Recombinasa Cre

Parvalbúmina

PV

Terminator

• Expresión de receptor de toxina diftérica de manera constitutiva y ubicua
• Sitios LoxP: reconocidos por recombinasa Cre

Modelo TERMINATOR - Enriquecimiento celular

5 días de depleción FBS

Día 7

Día 6

Día 5

+/Cre

PV - Ter

Lisis celular / IF

Día 12

Pase celular

Depleción de FBS

Día 3

• Lavados con PBS
• Cambio de medio + toxina diftérica (1:10'000)

Lavados + toxina

Día 1

• Cambio de medio + toxina diftérica (1:10'000)

Aplicación de toxina

• Aplicación de isoflurano + sacrificio
• Obtención de riñones (aséptico)
• Lavado (PBS) + machamiento (liberasa)
• Incubación a 37°C por 50-60 minutos
• Filtración + ciclos de lavado
• Siembra con medio DCT

Sacrificio y siembra

Día 0

CULTIVO DE CÉLULAS DCT - DISEÑO EXPERIMENTAL

RESULTADOS PREVIOS: MODELO TERMINATOR – ENRIQUECIMIENTO CON CÉLULAS DE DCT

Parvalbúmina

DAPI

DT

Control

RESULTADOS PREVIOS: MODELO TERMINATOR – ENRIQUECIMIENTO CON CÉLULAS DE DCT

A8301 ( + ) CHIR99021 ( + )

A8301 ( + ) CHIR99021 ( – )

A8301 ( – ) CHIR99021 ( – )

A8301 ( + ) CHIR99021 ( + )

A8301 ( + ) CHIR99021 ( – )

A8301 ( – ) CHIR99021 ( – )

Se colocó FITc-dextrán (fluoróforo) en cámara apical para evaluación de la monocapa (24 horas)

Evaluación de formación de monocapa

Resultados previos: Ensayo de transporte sensible a tiazidas

• Se realizó cambio de medio, por tanto, ambas cámaras inician con la misma concentración de electrolitos
• El transporte de sodio es apical-basolateral, se utilizaron cultivos control y DT +/- Vehículo/tiazida

Transporte de sodio de 24 horas

Resultados previos: Ensayo de transporte sensible a tiazidas

6. Yousef Yengej FA, Pou Casellas C, Ammerlaan CME, Olde Hanhof CJA, Dilmen E, Beumer J, et al. Tubuloid differentiation to model the human distal nephron and collecting duct in health and disease. Cell Reports [Internet]. 2024 Jan;43(1):113614. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113614

• CHIR99021 es un inhibidor de GSK-3β, impidiendo así la degradación de beta-catenina

• Se ha utilizado para inducir la diferenciación de diversos tipos celulares en contraciones que van de 1μM a 12μM

• La inactivación de GSK-3β de manera crónica genera diabetes insípida por alteraciones en la reabsorción de la nefrona distal

Avances: Curva de CHIR99021

Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO CONTROL

Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO DT

Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO DT

• La activación de la vía genera un aumento de β-catenina, que puede traslocarse al núcleo para generar sus efectos al unirse a factores de transcripción

• Esta involucrada en la estabilización de E-Cadherina al conectarla con el citoesqueleto (filamentos de activa)

• Involucrada con aumento de la actividad mitótica, especificación celular, polarización, regeneración, etc.

Lin WH, Cooper LM, Anastasiadis PZ. Cadherins and catenins in cancer: connecting cancer pathways and tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology [Internet]. 2023 May 15;11. Available from: http://dx.doi.org/10.3389/fcell.2023.1137013

Funciones de β-catenina

Grupo DT

Grupo control

Transición epitelio-mesénquima

DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.

Qian L, Yan J, Chen S, Abbas Karekad MM, Wu Y, Wu X, et al. Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments [Internet]. 2024 May 3;(207). Available from: http://dx.doi.org/10.3791/66638

• La activación de ROCK también se asocia con un aumento en la transición epitelio-mesénquima

• Se puede activar de manera directa por RHOA (GTPasa de la familia Rho) o de manera indirecta por la activación del receptor TGF-β

• Se ha utilizado para mantener el estado diferenciado de células epiteliales

Inhibición de ROCK (RHO-associated kinase)

¿Sólo es necesario impedir la transición epitelio-mesénquima y el mantenimiento de la monocapa?

Qian L, Yan J, Chen S, Abbas Karekad MM, Wu Y, Wu X, et al. Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments [Internet]. 2024 May 3;(207). Available from: http://dx.doi.org/10.3791/66638

• La activación de ROCK también se asocia con un aumento en la transición epitelio-mesénquima

• Se puede activar de manera directa por RHOA (GTPasa de la familia Rho) o de manera indirecta por la activación del receptor TGF-β

• Se ha utilizado para mantener el estado diferenciado de células epiteliales

Inhibición de ROCK (RHO-associated kinase)

Medio diferenciación

Medio expansión

DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.

DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.

Respuesta al bajo potasio

DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.

DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.

• Método estándar: mayor cantidad de liberasa, filtrado y doble centrifugación, más complejo.

• Suspensión de túbulos: menor cantidad de liberasa, sin filtración ni centrifugaciones. Mayor riesgo de contaminación. Más sencillo.

Suspensión de túbulos

Método estándar

Estandarización - Métodos de siembra

Triton-X100

Tween-20

• Se generaron partículas lentivirales que tenían como vector de transferencia el antigeno largo T de SV40
• Se enriquecieron cultivos primarios de riñón con células del DCT
• Se colocaron partículas virales, se seleccionó con puromicina y se expandieron las células.

Línea celular DCT-SV40