Desarrollo de un nuevo modelo celular para el estudio del túbulo contorneado distal
Márquez Salinas Alejandro
EXAMEN TUTORAL
Tutora: Dra. María Castañeda Bueno
Túbulo contorneado distal (DCT)
El DCT es la región de la nefrona localizada entre la mácula densa y el túbulo conector. Funciones:
- Reabsorción del 5-10% del NaCl filtrado
- Regulación de la secreción de K+
- Homeostasis del calcio y del magnesio
Se subdivide en dos segmentos:
- DCT temprano / DCT1
- DCT tardío / DCT2 (zona de transición con túbulo conector)
La proteína más importante de esta región de la nefrona es el cotransportador de sodio-cloro (NCC)
McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.
Células DCT1
Células DCT2
McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.
Células DCT1
Células DCT2
McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.
Regulación de NCC
- Dada la importancia de la función de NCC, se han hecho grandes esfuerzos por comprender su regulación.
- Actualmente sabemos que su actividad se regula principalmente a través de tres mecanismos:
- Activación de cinasas
- Activación de fosfatasas
- Degradación de componentes de la vía
Castañeda-Bueno M, Ellison DH, Gamba G. Molecular mechanisms for the modulation of blood pressure and potassium homeostasis by the distal convoluted tubule. EMBO Mol Med. el 7 de febrero de 2022;14(2):e14273 Carbajal-ContrerasH, et al. Arginine vasopressin regulates the renal Na + -Cl – and Na + -K + -Cl – cotransporters through with-no-lysine kinase 4 and inhibitor 1
Regulación de NCC
- Dada la importancia de la función de NCC, se han hecho grandes esfuerzos por comprender su regulación.
- Actualmente sabemos que su actividad se regula principalmente a través de tres mecanismos:
- Activación de cinasas
- Activación de fosfatasas
- Degradación de componentes de la vía
¿Por qué no hay un modelo celular? ¿Se han hecho intentos antes?
Castañeda-Bueno M, Ellison DH, Gamba G. Molecular mechanisms for the modulation of blood pressure and potassium homeostasis by the distal convoluted tubule. EMBO Mol Med. el 7 de febrero de 2022;14(2):e14273 Carbajal-ContrerasH, et al. Arginine vasopressin regulates the renal Na + -Cl – and Na + -K + -Cl – cotransporters through with-no-lysine kinase 4 and inhibitor 1
Pérdida del estado de diferenciación celular
- Las células pierden los estímulos que mantenían en el tejido nativo, provocando una pérdida de expresión de proteínas específicas a lo largo del tiempo
- Se ha demostrado que los métodos de siembra y el tratamiento de los platos con matrices (colágeno/fibronectina) ayudan a retrasar la pérdida de marcadores
Transwell:
Tubuloides:
Organ-on-a-chip:
OldeHanhofCJA,YousefYengejFA,RookmaakerMB,VerhaarMC,VanDerWijstJ, Hoenderop JG. Modeling Distal Convoluted Tubule (Patho)Physiology: An Overview of Past Developments and an Outlook Toward the Future. Tissue Eng Part C Methods. el 1 de marzo de 2021;27(3):200–12.
Pérdida del estado de diferenciación celular
- Las células pierden los estímulos que mantenían en el tejido nativo, provocando una pérdida de expresión de proteínas específicas a lo largo del tiempo
- Se ha demostrado que los métodos de siembra y el tratamiento de los platos con matrices (colágeno/fibronectina) ayudan a retrasar la pérdida de marcadores
Transwell:
Tubuloides:
Organ-on-a-chip:
¿Cómo mantener el estado diferenciado de estas células?
OldeHanhofCJA,YousefYengejFA,RookmaakerMB,VerhaarMC,VanDerWijstJ, Hoenderop JG. Modeling Distal Convoluted Tubule (Patho)Physiology: An Overview of Past Developments and an Outlook Toward the Future. Tissue Eng Part C Methods. el 1 de marzo de 2021;27(3):200–12.
Bloqueo de la transición epitelio-mesénquima
- La transición epitelio-mesénquima (EMT) es principalmente mediada por la unión de TGF-β a sus receptores
Proliferación + transición epitelio-mesénquima
- El inhibidor A8301 bloquea al receptor TGFβ-RI evitando estos efectos
- Se ha utilizado para el cultivo de tubuloides de riñón de células humanas.
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Activación de la vía Wnt - β-catenina
- Involucrada con aumento de la actividad mitótica, especificación celular, polarización, regeneración, etc.
- La activación de la vía genera un aumento de β-catenina, que se trasloca al núcleo para generar sus efectos
- El CHIR99021 inhibe de manera específica a GSK3β, aumentando la concentración de β-catenina
Rim EY, Clevers H, Nusse R. The Wnt Pathway: From Signaling Mechanisms to Synthetic Modulators. Annual Review of Biochemistry [Internet]. 2022 Jun 21;91(1):571–98. Available from: http://dx.doi.org/10.1146/annurev-biochem-040320-103615
Justificación
El desarrollo de un modelo de cultivo celular diferenciado del DCT facilitará el estudio detallado de la regulación del NCC, lo cual permitirá ampliar nuestra comprensión de la fisiología renal y de los mecanismos subyacentes a la hipertensión arterial sistémica.
Objetivos
Generar un nuevo modelo celular diferenciado del DCT
- Generar una metodología que permita el enriquecimiento del cultivo con células del DCT
- Identificar el rol de las vía de TGF-β y de Wnt para el mantenimiento del estado diferenciado de las células del DCT
- Realizar la validación del modelo
- Generar una nueva línea celular con inmortalización inducible
Modelo TERMINATOR - Enriquecimiento celular
- Expresión de receptor de toxina diftérica de manera constitutiva y ubicua
- Sitios LoxP: reconocidos por recombinasa Cre
Terminator
PV
Parvalbúmina
Recombinasa Cre
Promotor de parvalbúmina
- Expresión de recombinasa Cre dependiente de promotor de parvalbúmina
+/Cre
Presencia de recombinasa Cre en células que sintetizan parvalbúmina
Receptor de toxina difética
Lox P
Lox P
Rosa 26
- Células del DCT no expresan receptor de tóxina diftérica
PV - Ter
+/Cre
Receptor de toxina diftérica
Lox P
Lox P
Rosa 26
Guo J-K, Shi H, Koraishy F, Marlier A, Ding Z, Shan A, et al. The Terminator mouse is a diphtheria toxin–receptor knock-in mouse strain for rapid and efficient enrichment of desired cell lineages. Kidney International [Internet]. Elsevier BV; 2013 Nov;84(5):1041–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/ki.2013.202
CULTIVO DE CÉLULAS DCT - DISEÑO EXPERIMENTAL
Sacrificio y siembra
Pase celular
Aplicación de toxina
- Aplicación de isoflurano + sacrificio
- Obtención de riñones (aséptico)
- Lavado (PBS) + machamiento (liberasa)
- Incubación a 37°C por 50-60 minutos
- Filtración + ciclos de lavado
- Siembra con medio DCT
- Cambio de medio + toxina diftérica (1:10'000)
5 días de depleción FBS
Día 6
Día 0
Día 7
Día 3
Día 5
Día 12
Día 1
Lisis celular / IF
Lavados + toxina
Depleción de FBS
- Lavados con PBS
- Cambio de medio + toxina diftérica (1:10'000)
PV - Ter
+/Cre
RESULTADOS PREVIOS: MODELO TERMINATOR – ENRIQUECIMIENTO CON CÉLULAS DE DCT
Control
DT
DAPI
Parvalbúmina
RESULTADOS PREVIOS: MODELO TERMINATOR – ENRIQUECIMIENTO CON CÉLULAS DE DCT
A8301 ( + ) CHIR99021 ( – )
A8301 ( + ) CHIR99021 ( + )
A8301 ( – ) CHIR99021 ( – )
A8301 ( + ) CHIR99021 ( – )
A8301 ( + ) CHIR99021 ( + )
A8301 ( – ) CHIR99021 ( – )
Resultados previos: Ensayo de transporte sensible a tiazidas
Evaluación de formación de monocapa
Se colocó FITc-dextrán (fluoróforo) en cámara apical para evaluación de la monocapa (24 horas)
Resultados previos: Ensayo de transporte sensible a tiazidas
Transporte de sodio de 24 horas
- Se realizó cambio de medio, por tanto, ambas cámaras inician con la misma concentración de electrolitos
- El transporte de sodio es apical-basolateral, se utilizaron cultivos control y DT +/- Vehículo/tiazida
Avances: Curva de CHIR99021
- CHIR99021 es un inhibidor de GSK-3β, impidiendo así la degradación de beta-catenina
- Se ha utilizado para inducir la diferenciación de diversos tipos celulares en contraciones que van de 1μM a 12μM
- La inactivación de GSK-3β de manera crónica genera diabetes insípida por alteraciones en la reabsorción de la nefrona distal
6. Yousef Yengej FA, Pou Casellas C, Ammerlaan CME, Olde Hanhof CJA, Dilmen E, Beumer J, et al. Tubuloid differentiation to model the human distal nephron and collecting duct in health and disease. Cell Reports [Internet]. 2024 Jan;43(1):113614. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113614
Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO CONTROL
Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO DT
Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO DT
Funciones de β-catenina
- Involucrada con aumento de la actividad mitótica, especificación celular, polarización, regeneración, etc.
- La activación de la vía genera un aumento de β-catenina, que puede traslocarse al núcleo para generar sus efectos al unirse a factores de transcripción
- Esta involucrada en la estabilización de E-Cadherina al conectarla con el citoesqueleto (filamentos de activa)
Lin WH, Cooper LM, Anastasiadis PZ. Cadherins and catenins in cancer: connecting cancer pathways and tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology [Internet]. 2023 May 15;11. Available from: http://dx.doi.org/10.3389/fcell.2023.1137013
Grupo control
Grupo DT
Transición epitelio-mesénquima
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Inhibición de ROCK (RHO-associated kinase)
- La activación de ROCK también se asocia con un aumento en la transición epitelio-mesénquima
- Se puede activar de manera directa por RHOA (GTPasa de la familia Rho) o de manera indirecta por la activación del receptor TGF-β
- Se ha utilizado para mantener el estado diferenciado de células epiteliales
Qian L, Yan J, Chen S, Abbas Karekad MM, Wu Y, Wu X, et al. Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments [Internet]. 2024 May 3;(207). Available from: http://dx.doi.org/10.3791/66638
Inhibición de ROCK (RHO-associated kinase)
- La activación de ROCK también se asocia con un aumento en la transición epitelio-mesénquima
- Se puede activar de manera directa por RHOA (GTPasa de la familia Rho) o de manera indirecta por la activación del receptor TGF-β
- Se ha utilizado para mantener el estado diferenciado de células epiteliales
¿Sólo es necesario impedir la transición epitelio-mesénquima y el mantenimiento de la monocapa?
Qian L, Yan J, Chen S, Abbas Karekad MM, Wu Y, Wu X, et al. Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments [Internet]. 2024 May 3;(207). Available from: http://dx.doi.org/10.3791/66638
Medio diferenciación
Medio expansión
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Respuesta al bajo potasio
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Estandarización - Métodos de siembra
- Método estándar: mayor cantidad de liberasa, filtrado y doble centrifugación, más complejo.
- Suspensión de túbulos: menor cantidad de liberasa, sin filtración ni centrifugaciones. Mayor riesgo de contaminación. Más sencillo.
Método estándar
Suspensión de túbulos
Tween-20
Triton-X100
Línea celular DCT-SV40
- Se generaron partículas lentivirales que tenían como vector de transferencia el antigeno largo T de SV40
- Se enriquecieron cultivos primarios de riñón con células del DCT
- Se colocaron partículas virales, se seleccionó con puromicina y se expandieron las células.
EXAMEN TUTORAL 4
Alejandro Márquez Sa
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Transcript
Desarrollo de un nuevo modelo celular para el estudio del túbulo contorneado distal
Márquez Salinas Alejandro
EXAMEN TUTORAL
Tutora: Dra. María Castañeda Bueno
Túbulo contorneado distal (DCT)
El DCT es la región de la nefrona localizada entre la mácula densa y el túbulo conector. Funciones:
Se subdivide en dos segmentos:
La proteína más importante de esta región de la nefrona es el cotransportador de sodio-cloro (NCC)
McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.
Células DCT1
Células DCT2
McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.
Células DCT1
Células DCT2
McCormick JA, Ellison DH. Distal Convoluted Tubule. Comprehensive Physiology. Wiley; 2014 Dec 23;45–98. Subramanya AR,. Distal Convoluted Tubule. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. American Society of Nephrology (ASN); 2014 May 22;9(12):2147–63.
Regulación de NCC
Castañeda-Bueno M, Ellison DH, Gamba G. Molecular mechanisms for the modulation of blood pressure and potassium homeostasis by the distal convoluted tubule. EMBO Mol Med. el 7 de febrero de 2022;14(2):e14273 Carbajal-ContrerasH, et al. Arginine vasopressin regulates the renal Na + -Cl – and Na + -K + -Cl – cotransporters through with-no-lysine kinase 4 and inhibitor 1
Regulación de NCC
¿Por qué no hay un modelo celular? ¿Se han hecho intentos antes?
Castañeda-Bueno M, Ellison DH, Gamba G. Molecular mechanisms for the modulation of blood pressure and potassium homeostasis by the distal convoluted tubule. EMBO Mol Med. el 7 de febrero de 2022;14(2):e14273 Carbajal-ContrerasH, et al. Arginine vasopressin regulates the renal Na + -Cl – and Na + -K + -Cl – cotransporters through with-no-lysine kinase 4 and inhibitor 1
Pérdida del estado de diferenciación celular
Transwell:
Tubuloides:
Organ-on-a-chip:
OldeHanhofCJA,YousefYengejFA,RookmaakerMB,VerhaarMC,VanDerWijstJ, Hoenderop JG. Modeling Distal Convoluted Tubule (Patho)Physiology: An Overview of Past Developments and an Outlook Toward the Future. Tissue Eng Part C Methods. el 1 de marzo de 2021;27(3):200–12.
Pérdida del estado de diferenciación celular
Transwell:
Tubuloides:
Organ-on-a-chip:
¿Cómo mantener el estado diferenciado de estas células?
OldeHanhofCJA,YousefYengejFA,RookmaakerMB,VerhaarMC,VanDerWijstJ, Hoenderop JG. Modeling Distal Convoluted Tubule (Patho)Physiology: An Overview of Past Developments and an Outlook Toward the Future. Tissue Eng Part C Methods. el 1 de marzo de 2021;27(3):200–12.
Bloqueo de la transición epitelio-mesénquima
Proliferación + transición epitelio-mesénquima
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Activación de la vía Wnt - β-catenina
Rim EY, Clevers H, Nusse R. The Wnt Pathway: From Signaling Mechanisms to Synthetic Modulators. Annual Review of Biochemistry [Internet]. 2022 Jun 21;91(1):571–98. Available from: http://dx.doi.org/10.1146/annurev-biochem-040320-103615
Justificación
El desarrollo de un modelo de cultivo celular diferenciado del DCT facilitará el estudio detallado de la regulación del NCC, lo cual permitirá ampliar nuestra comprensión de la fisiología renal y de los mecanismos subyacentes a la hipertensión arterial sistémica.
Objetivos
Generar un nuevo modelo celular diferenciado del DCT
Modelo TERMINATOR - Enriquecimiento celular
Terminator
PV
Parvalbúmina
Recombinasa Cre
Promotor de parvalbúmina
+/Cre
Presencia de recombinasa Cre en células que sintetizan parvalbúmina
Receptor de toxina difética
Lox P
Lox P
Rosa 26
PV - Ter
+/Cre
Receptor de toxina diftérica
Lox P
Lox P
Rosa 26
Guo J-K, Shi H, Koraishy F, Marlier A, Ding Z, Shan A, et al. The Terminator mouse is a diphtheria toxin–receptor knock-in mouse strain for rapid and efficient enrichment of desired cell lineages. Kidney International [Internet]. Elsevier BV; 2013 Nov;84(5):1041–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/ki.2013.202
CULTIVO DE CÉLULAS DCT - DISEÑO EXPERIMENTAL
Sacrificio y siembra
Pase celular
Aplicación de toxina
5 días de depleción FBS
Día 6
Día 0
Día 7
Día 3
Día 5
Día 12
Día 1
Lisis celular / IF
Lavados + toxina
Depleción de FBS
PV - Ter
+/Cre
RESULTADOS PREVIOS: MODELO TERMINATOR – ENRIQUECIMIENTO CON CÉLULAS DE DCT
Control
DT
DAPI
Parvalbúmina
RESULTADOS PREVIOS: MODELO TERMINATOR – ENRIQUECIMIENTO CON CÉLULAS DE DCT
A8301 ( + ) CHIR99021 ( – )
A8301 ( + ) CHIR99021 ( + )
A8301 ( – ) CHIR99021 ( – )
A8301 ( + ) CHIR99021 ( – )
A8301 ( + ) CHIR99021 ( + )
A8301 ( – ) CHIR99021 ( – )
Resultados previos: Ensayo de transporte sensible a tiazidas
Evaluación de formación de monocapa
Se colocó FITc-dextrán (fluoróforo) en cámara apical para evaluación de la monocapa (24 horas)
Resultados previos: Ensayo de transporte sensible a tiazidas
Transporte de sodio de 24 horas
Avances: Curva de CHIR99021
6. Yousef Yengej FA, Pou Casellas C, Ammerlaan CME, Olde Hanhof CJA, Dilmen E, Beumer J, et al. Tubuloid differentiation to model the human distal nephron and collecting duct in health and disease. Cell Reports [Internet]. 2024 Jan;43(1):113614. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113614
Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO CONTROL
Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO DT
Avances: IF CDH1 - NCC - GRUPO DT
Funciones de β-catenina
Lin WH, Cooper LM, Anastasiadis PZ. Cadherins and catenins in cancer: connecting cancer pathways and tumor microenvironment. Frontiers in Cell and Developmental Biology [Internet]. 2023 May 15;11. Available from: http://dx.doi.org/10.3389/fcell.2023.1137013
Grupo control
Grupo DT
Transición epitelio-mesénquima
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Inhibición de ROCK (RHO-associated kinase)
Qian L, Yan J, Chen S, Abbas Karekad MM, Wu Y, Wu X, et al. Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments [Internet]. 2024 May 3;(207). Available from: http://dx.doi.org/10.3791/66638
Inhibición de ROCK (RHO-associated kinase)
¿Sólo es necesario impedir la transición epitelio-mesénquima y el mantenimiento de la monocapa?
Qian L, Yan J, Chen S, Abbas Karekad MM, Wu Y, Wu X, et al. Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments [Internet]. 2024 May 3;(207). Available from: http://dx.doi.org/10.3791/66638
Medio diferenciación
Medio expansión
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Respuesta al bajo potasio
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
DongreA,WeinbergRA. New insights into the mechanisms of epithelial–mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. febrero de 2019;20(2):69–84.XuJ,LamouilleS,DerynckR.TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.Cell Res. febrero de 2009;19(2):156–72.
Estandarización - Métodos de siembra
Método estándar
Suspensión de túbulos
Tween-20
Triton-X100
Línea celular DCT-SV40