Microssatélites

Instituto Politécnico de Lisboa Escola Superior de Tecnologia e Saúde de Lisboa Curso de Ciências Biomédicas Laboratoriais Unidade Curricular: Génetica Humana 1º Semestre – 2º Ano

MICROSSATÉLITES

STR's

10.

9.

Caso 4 - Diversidade Populacional

Conceitos importantes

Variabilidade

8.

Conclusão e apontamentos finais

7.

6.

5.

4.

1.

2.

3.

O que são?

Qual é a sua utilidade?

Caso 3 - Transfusões

Caso 2 - Criminal

Caso 1 - Paternidade

Caso 5 - Feito em aula

Índice

O QUE SÃO?

Os microssatélites, ou STR's (Short Tadem Repeats), são pequenas sequências repetidas em Tandem, de 2 a 6 pb, localizadas em regiões não codificantes do genoma. Encontram-se espalhados pelo genoma, o que permite analisar diferentes regiões cromossómicas, e são extremamente variáveis entre invidíduos. Por haver alta variabilidade, tornam-se bons marcadores polimórficos. Consequentemente, são ferramentas utilizadas para vários estudos genéticos.

Variabilidade do número de repetições

O aumento ou diminuição do número de repetições é ditado pela formação de hairpins, durante a replicação de DNA. - Se estes se formarem na sequência de Okazaki, haverão mais repetições a serem sintetizadas pela DNA polimerase do que as que estariam na cadeia molde. -Se os hairpins se formarem na cadeia molde, a DNA polimerase passa a parte dobrada à frente, havendo uma redução do número de repetições, na sequência de Okazaki.

É um gráfico gerado por um sequenciador de DNA e, representa a separação de fragmentos de DNA por tamanho. Cada pico no gráfico corresponde a um STR's de um determinado tamanho.

Sistema usado pelo FBI, para relacionar casos e crimes por resolver. O Combined DNA Index System impede falsos positivos, utilizando pelo menos 13 STR's, onde tem de haver correspondência em todos.

Técnica de amplificação de várias regiões do DNA, em simultâneo. Cada região a amplificar, possui um par de primers específico. Alta sensibilidade e permite colocar marcadores que distinguem os STR's.

CONCEITOS IMPORTANTES

Quais são as utilidades da análise com STR's?

Como os STR's são, combinados entre si, uma moeda de identificação única, podem servir para identificação individual.Porém, por serem evolutivamente neutros em alguns loci específicos, conseguimos associá-los e utilizá-los em estudos populacionais.

De uma forma geral vamos abordar:Testes de paternidade; Genética forense; Eficiência de transplantes; Diversidade genética.

Amplificação das sequências STR´s. Ao usarmos o Multiplex PCR, tornamos os resultados mais sensiveis e com maior quantidade de comparação.

Utilizamos 1 par de primers para cada STR's. Fragmentos separados por eletroforese. A cada um dos fragmentos é adicionado um fluoróforo, sendo possível vê-lo.

DNA extraido de células epiteliais bucais, ou sanguíneas, para ser amplificado.

Testes de Paternidade

Tipos Resultados

Teste de paternidade

Tipos Resultados

Teste de paternidade

Avaliação de Eficiência de transplantes

Para avaliar a eficiência de um transplante alogénico (de um dador para o recetor) também se podem usar STR's. Quando o doente recebe as células do doador, estas devem substituir as dele. Desta forma, através dos picos do eletroferograma, concluimos se houve uma substituição, mistura, ou falha de substituição das células do doador, no orgão/tecido transplantado. - QUIMERA.

DIVERSIDADE GENÉTICA ENTRE A POPULAÇÃO

Em diversos estudos, os microssatélites, são utilizados como forma de analisar os loci que mantiveram o número de repetições comuns, em termos evolutivos, em diferentes populações. Desta maneira, podemos associar o número de repetições de STR's, com as nossas origens.

Encontraro criminoso

Extraçãode DNA's

Amplificaçãode STR's

Colocaçãode Fluoróforos

Comparar STR's, entre amostras

Genética Forense

Aqui todo o processo é o mesmo, mas utilizando uma amostra retirada do local do crime e outra(s) do(s) suspeito(s). Se houver uma vítima, esta também deve entrar na comparação de amostras. Porém, se houver suspeita de amotra misturada (ex: sangue misturado), deve-se ignorar os picos da vítima, para verificar a identidade total do suspeito.

O que queremos?

Descobrimos a nossa criminosa

EM AULA

STR

PasSo 1

O que analisamos?

Amostras

Passo 2

O que temos?

Objetivo

Passo 3

Amplificar o Locus - PCR

Passo 4

Eletroforese - Gel

Passo 5

Resultados

Passo 6

Podemos então concluir que o suspeito A, tem correspondência total com os alelos da amostra x, sendo o criminoso. Caso fosse feito o eletroferograma, no pico da amelogenina, verificaríamos o aparecimento de 1 ou 2 picos, sabendo assim o sexo do indivíduo.

Conclui-se que as aplicações dos STR's revolucionaram diversas áreas da ciência, em especial a genética forense e a medicina. Essas sequências de DNA, possuem uma variabilidade extraordinária entre indivíduos, tornando-as marcadores genéticos extremamente valiosos. Trouxe ainda inúmeros benefícios para a sociedade como justiça e saúde. Existem questões éticas que podem ser levantadas relativamente à privacidade dos dados genéticos e à utilização de bancos de dados de DNA que devem ser consideradas.

Conclusão

Outros exemplos:

• Identificação de restos humanos.
• Relações de parentesco (membros mais afastados do que propriamente pai e filho).
• História evolutiva (reconstrução evolutiva, das espécies que nos antecederam).
• Mapeamento genético de doenças e outras características.
• Autenticidade de linhagens celulares utilizadas em pesquisas biotecnológicas.
• Autenticidade dos alimentos e deteção de fraudes na origem dos mesmos.

Temos diponíveis as seguintes amostras: 1- a amostra "x" corresponde à porção retirada do local do crime. 2- a amostra do suspeito A. 3- a amostra do suspeito B. 4- a amostra do suspeito C. 5- a amostra do duspeito D.

Amostras

Foi colocada uma amostra em cada tubo, de forma separada. Adicionou-se Master Mix (Mix enzima+primers) a todas as amostras. O PCR foi feito e os STR's TH01 foram amplificados.

Amplificar o Locus - PCR

Resultados

Eletroforese - Gel

Preparou-se o gel de agarose 3%, malha mais apertada, indicada para fragmentos menores. Colocou-se Red Safe. Adicionar às amostras, solução de aplicação. Colocá-las nos poços e deixar a eletroforese correr.

https://www.mdpi.com/1467-3045/45/9/460 https://www.testepaternidade.pt/ciencia-no-teste-de-paternidade/ https://www.vetprofissional.com.br/artigos/tecnica-de-reacao-em-cadeia-da-polimerase-pcr-para-que-serve https://pt.slideshare.net/slideshow/forensic-significance-of-dna-profiling-forensic-biology/250994733 https://blog.meudna.com/coleta-de-dna-da-saliva-como-funcionanbsp/ https://pt.wikipedia.org/wiki/Microssatélite https://guiadoestudante.abril.com.br/estudo/5-curiosidades-sobre-o-monge-gregor-mendel-cientista-pai-da-genetica#google_vignette\ http://www.geneprolab.com/technology_overview.html https://www.bcgsc.ca/news/straglr-new-software-tool-targeted-genotyping-and-repeat-expansion-detection https://www.openaccessgovernment.org/first-images-dna-human-cells/35779/ https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022907600096

Bibliografia

Na vida real, a correspondência de um só alelo não seria suficiente para culpar alguém de um crime. Daí usarmos o CODIS 13. A probabilidade dos 13 alelos serem correspondentes é de 1 em 594 triliões.

Objetivo

O principal objetivo do procedimento feito em aula, foi descobrir qual dos 4 suspeitos correspondia ao alelo da amostra "x", no locus TH01. Se houvesse correspondência entre alelos, diríamos que esse mesmo suspeito era ocorrespondente ao da amostra "x" e, portanto, cometera o crime.

STR

STR-TH01

O STR tem cerca de 20 alelos diferentes. Localização: 11p15.5 Como já aprendemos, trata-se do cromossoma 11, braço pequeno, região 1, banda 5 e sub-banda 5. Núcleotidos repetidos: 4 Sequência: TCAT