PRESENTACIÓN CIENCIA Y SALUD

Tema 10

DUPLICACIÓ DEL DNA I BIOSÍNTESI DE LES PROTEÏNES

L’ADN durant la vida de la cèl·lula té dues funcions:-Transmetre la informació genètica que conté a la descendència (replicació o duplicació). -Expressar la informació que conté en forma de proteïnes (transcripció i traducció).

El dogma central de la biologia molecular és la capacitat de l’ADN per duplicar-se a ell mateix o transcriure’s al RNA i traduir-lo al llenguatge proteic delsaminoàcids

1.1 La necessitat de la duplicació del DNA

1. La duplicació del DNA

La durada de la vida dels organismes és molt variable, però sempre hi ha un moment en què els organismes moren, tots els éssers vius són temporals. Per tant hi ha un moment en què els individus es reprodueixin i donin lloc a nous individus. Per això és necessària la formació de còpies del DNA del progenitor o prognitors que passen a cada nou individu.

Es plantegen tres hipòtesis per explicar la duplicació del DNA:-Hipòtesis semiconservadora: les dues cadenes del DNA inicial es separen i cadascuna serveix de motlle per a la síntesi d’una nova cadena. Per tant, en les dues molècules del DNA produïdes, un dels filaments seria l’antic, i l’altre, el modern. -Hipòtesis conservadora: després de la duplicació queden, d’una banda, els dos filaments antics junts i, de l’altra, els dos filaments nous també espiralitzats. L’inicial queda intacte. -Hipòtesis dispersiva: els filaments, al final, estan constituïts per una mescla de fragments de DNA antic i de DNA acabat de sintetitzar. L’inicial es trenca a trossets i d’aquests es formen els filaments.

’L'experiment de Meselson i Stahl, definitiu per dilucidar quina d'aquestes hipòtesis era la correcta: HIPÒTESIS SEMICONSERVADORA

1.2 Les primeres hipòtesis sobre la duplicació del DNA

1. La duplicació del DNA

Per originar nous individus és necessària la formació de còpies del DNA progenitor o progenitors (si s’engendren per la unió de dos gàmetes), que passen a ca nou individu. Es parteix d’una quantitat de material genètic i es copia, fent servir de mostra el que es tenia al principi.

La DNA polimersa és incapaç d'iniciar una cadena de novo, només és capaç d'afegir nucleòtids a l'extrem d'una cadena preexistent (el encebador o primer). L'energia necessària per a unir el següent nucleòtid el pren dels dos grups fosfats de nucleòtids trifosfats. La DNA-polimerasa actua sintetitzant un nou filament antiparal·le i complematari al filament patró. Després d'unir cada nucleòtid comprova si s'han produït errors abans d'incorporar el nucleòtid següent. Si detecta un error, elimina l'últim nucleòtid col·locat i ho substiueix pel correcte, doncs té una funció autocorrectora.

2.1 La síntesi del DNA in vitro

2. Sentit de creixement de nous filaments

Arthur Kornberg, deixeble del bioquimic espanyol Severo Ochoa, va estudiar el mecanisme pel qual a partir d’un filament s’hisintetitzava un d’altre i quin enzim regulava aquest procés: DNA-polimerasa.Per fer-ho va realitzar un experiment on va aïllar el DNA-polimerasa i va observar els seu funcionament als cultius in vitro, es necessiten: -nucleòtids (A, T, C, G) -ions magnesi (per a que els enzims treballin) -DNA patró (cadena mare, DNA inicial) -DNA encebador (petit fragment de RNA que ja ha començat la còpia) -DNA-polimerasa (enzim que enganxa els nucleòtids en direcció 5'-3')

Aquest fet va platejar dos dilemes: el primer era com la DNA-polimersa pot sintetitzar sense necessitat d'encebador, i com els dos filaments de la forqueta creixen en paral·lel si un ho feia en direcció 5'-3', l'altre ho hauria de fer en direcció 3'-5', la qual cosa era impossible.

2.2 La síntesi del DNA in vivo

2. Sentit de creixement de nous filaments

Erròniament, es va deduir que la replicació era unidireccional, però posteriorment s'ha comprovat que és bidireccional, és a dir, hi ha una forqueta a l'esquerra del punt d'inici: Origen de replicació, i una altra forqueta a la dreta, que van progressant en direccions oposades. En DNA circular, es produeix una sola forqueta de replicació, de transcripció bidireccional. En eucariotes es produeixen diverses forquetes al llarg de tot el bri de DNA.

L'RNA dels fragments de Okazaki és sintetitzat per la RNA-polimerasa , que no necessita engreixador, i després la hi DNA-polimerasa, que ja té aquest fragmento engreixador, comença a sintetitzar el DNA. Per tant en la forqueta de replicació veiem que des de l'origen de replicació, en direcció 5' -3' la cadena creix de manera contínua, però en el sentit 3'-5' el creixement és discontinu, o retardat, a trossos que després s'uniran (fragments de Okazaki)

2.2 La síntesi del DNA in vivo

2. Sentit de creixement de nous filaments

En 1968, el descobriment que va fer el matrimoni Okazaki va resoldre el problema. Van descobrir que en les cèl·lules en replicació abundaven uns fragments formats per una cadena d'RNA d'uns 50 nucleòtids, i a continuació unida a ella una seqüència més llarga (1000-2000 nucleòtids) de DNA. A aquestes cadenes híbrides d'RNA-DNA se'ls denomina Fragments de Okazaki.

3.1el mecanisme de la dupliació en bacteris

3. Mecanisme de la duplicació del DNA

La duplicació del DNA presenta algunes diferències en bacteris i en eucariotes. La replicació de l'ADN es va estudiar principalment en el bacteri Escherichia coli (E. coli):1.- En el DNA existeixen seqüències determinades de nucleòtids que assenyalen els punts d'origen de la replicació, actuant com a senyal d'iniciació. 2.- Els enzims anomenats topoisomerases I i II desenrotllen la cadena de DNA, i la tallen si és necessari (topoisomerases I tallen cadenes simples, topoisomerases II cadenes dobles) i les empalmen novament. La topoisomerasa II d'E. coli, també es diu girasa. 3.- L'enzim helicasa s'encarrega de trencar els ponts d'hidrogen que mantenen unida la doble hèlix, separant les dues fibres. 4.- A continuació, hi intervenen unes proteïnes estabilitzadores (SSB) que mantenen la separció dels dos filaments complementaris. I així s'inicia la formació de la forqueta de replicació.

3.1el mecanisme de la dupliació en bacteris

3. Mecanisme de la duplicació del DNA

Fase d'elongació:Com ja s'ha dit, des de l'origen de replicació es comença a elongar la cadena en totes dues adreces: procés bidireccional, hi ha una helicasa que treballa en un sentit i una altra treballa en sentit oposat. Tenim dues forquetes de replicació que formen bombolles o ulls de replicació. 5.- RNA-polimerasa o primasa (que pot actuar sense encebador): sintetitza un fragment curt d'RNA anomenat primer, que actua com a encebador. 6.- La DNA-polimerasa III, a partir del primer (encebador) comença a sintetitzar un filament de DNA en direcció 5'-3'. Este filamente és de creixement continu (l'helicasa no s'atura), filament conductor. 7.- L'altre filament, antiparal·lel, filament de creixement discontinu, filament retardat: l'RNA-polimerasa cada aproximadament mil nucleòtids, sintetitza una cadena curta (40-50 nucleòtids) d'RNA. La DNA polimerasa III, afegeix nucleòtids de DNA a partir d'aquest RNA engreixador: són els fragments de Okazaki.

3.1el mecanisme de la dupliació en bacteris

3. Mecanisme de la duplicació del DNA

Fase d'elongació: 8- Fragments de Okazaki: La DNA-polimerasa I retira els segmets d'RNA i omple els buits amb nucleòtids de DNA. Després una DNA-ligasa empalma els diferents fragments. 9.- El procés continua d'aquesta manera fins a la duplicació total del DNA.

3.2el mecanisme de la dupliació en eucariotes

3. Mecanisme de la duplicació del DNA

És un procés semblant al de bacteris amb algunes diferències: -El DNA dels eucariotes està associat a histones, per tant durant la duplicació les histones velles queden associades al filament conductor i el filament retardat tindrà noves histones. -La longitud del DNA eucariòtic és superior al DNA bacterià i per la presènciad’histones el procés és bastant més lent. És per això que en cada DNA d’uncromosoma no hi ha només un origen de replicació, sinó aporx un centenar. S’hi formen bombolles de replicació que s’activen de manera coordinada i constitueixen unitats de replicació o replicons

4.1 la investigació de garrod

4. La teoria "un gen - un enzim"

Es va descobrir com el missatge del DNA es materialitza en les característiques de l'organisme gràcies als experiments realitzats per Garrod en 1901. Va estudiar malalties humanes com la alcaptonúria (produeix artritisme i ennegriment dels cartílags i de l'orina), A descobrir que -Era una malatia hereditària: sempre hi havia algun antepassat que n'havia patit. -Era recessiva, és a dir s'havia de rebre el gen per part dels dos pares (homozigot recessiu nn). No es produïa la malaltia en cas d'homozigot dominant (NN) o heterozigot (Nn). Va esbrinar que el motiu de l'ennegriment de l'orina i els cartílags era degut a la presència de l'acid homogentísic, i així es va poder passar d'un paral·lelisme entre gen i caràcter a gel i substància:

CONCEPTES GENÈTICS BÀSICS

Gen: Fragment d'àcid nucleic que duu informació per a un caràcter. Correspon al terme factor hereditari utilitzat per MendelLocus: És el lloc que ocupa un gen en el cromosoma. Plural: Loci. Diploide: Ésser que té dos cromosomes de cada tipus. Un és heredat del pare i l'altre, de la mare. Haploide: Ésser que només té un cromosoma de cada tipus. Gen dominant: Gen que imposa la seva información, és a dir, que no deixa que s'expressi l'altre gen que porta informació sobre el mateix caràcter i que rep el nom de Gen Recessiu. Al·lel: Cadascun dels diferents gens que poden ocupar un mateix locus. En un ser diploide, per cada caràcter hi ha dos gens que són al·lels entre si.

4.1 la investigació de garrod

4. La teoria "un gen - un enzim"

En 1948 Beadle i Tatum, van cultivar un fong (Neurospora crassa) que per viure tan sols necessita minerals, font orgánica de carboni i biotina (vitamina B7).Per radiació amb rajos ultraviolats (que alteren el DNA), van originar mutants que només sobrevivien si a més s'hi afegia l'aa arginina, (havíen perdut la capacitat de sintetizar aquest aa). Altres mutants necessitaven Arg o citrulina, altres mutants necessitaven Arg o citrulina o ornitina. Els diferents mutants estaven mancats de determinats enzims, i per tant el metabolisme queda bloquejat en aquella substància sobre la qual havia d'actuar. Així es va establir un paral·lelisme entre gens i enzims, i aquesta hipòtesi, es va anomenar teoria d'un gen - un ezim.. Més endavant es descobreix que no totes les proteïnes són enzims i que moltes proteïnes es formen a partir de més d’una cadena polipeptídica. Per tantla teoria gen-enzim es revisa i passa a ser un gen-un polipèptid. Cada gen codifica la formació d’un enzim. La informació que conté un gen s’acaba convertint en un enzim. ➔ Si un gen està alterat no es podrà fer la síntesis de l’enzim. ➔ Els enzims són proteïnes biocatalitzadores de les reaccions químiques de l’organisme, fan que les reaccions químiques vagin més ràpid

5. L'expressió del missatge genètic

En el nucli cel·lular es realitza la còpia del DNA per a la següent generació cel·lular. Replicació de l'ADN Crick va proposar l'anomenada "hipòtesi de la col·linearitat", en la qual s'estableix una correspondència entre la seqüència de nucleòtids del gen i la seqüència d'aminoàcids de l'enzim que el gen codifica. Al DNA cel·lular, en eucariotes al nucli, es passa d'una seqüencia de bases nitrogenades d'un gen a una seqüencia de bases nitrogenades complementàries en un RNAm. Aquest procés rep el nom de transcripció. En els ribosomes es passa d'una seqüència de nucleòtids d'aquest RNAm a una seqüència d'aminoàcids. Procés anomenat Traducció. Posteriorment es va descobrir que alguns virus poden produir DNA a partir del seu RNA, procès que s'anomena transcripció inversa.

Severo Ochoa i el seu deixeble Arthur Kornberg, van rebre el premi nobel de medicina en 1959 pels seus descobriments en la duplicació i la transcripció.

5.1 El mecanisme de la transcripció

5. L'expressió del missatge genètic

La transcripció és el pas d'una seqüencia de DNA a una seqüencia d'RNA, tant si és RNAm com RNAr o RNAt. Es necessiten: -el DNA original, -ribonucleòtids trifosfat (ATP, UTP, CTP i GTP) -RNA-polimerases -cofactors. Sentit de creixement 5'-3' Es copia una sola cadena del DNA Se'n poden distinguir dos mecanismes diferents, segons si es tracta de bacteris o de cèl.lules eucariotes.

La transcripció en procariotes

5. L'expressió del missatge genètic

Els bacteris només tenen un tipus d'RNA-polimerasa. 1.- Iniciació: -Al DNA existeixen unes seqüències denominades promotores (que no es transcriuen) a partir de les quals s'estableix la unitat de transcripció. -El promotor conté unes seqüències de nucleòtids, anomenades seqüències consens que són detectades per la RNA polimerasa. -El promotor determina quina de les dues cadenes ha de ser transcrita. -Una vegada fixada (RNA polimerasa) es desanrotlla la cadena i comença la síntesi. -La cadena copiada s'anomena patró. 2.- Allargament o elongació: -La RNA-polimerasa recorre la cadena codificadora cap a l'extreme 5', i es produeix la síntesi del RNA en direcció 5' - 3'

La transcripció en procariotes

5. L'expressió del missatge genètic

3.- Terminació o acabament: -La transcripció acaba quan l'RNA-polimerasa arriba a una seqüència anomenada terminador, que està formada per G i C seguides de diverses T i que origina un bucle al final de l'RNA. Aquesta seqüència s'anomena seqüènica d'acabament. -L'RNA-polimerasa es separa i el DNA torna a formar el doble hèlix. 4.- Maduració: -Es dóna o no segons el tipus de RNA sintetitzat: -RNAm: directament té lloc la traducció, donant lloc a una proteïna funcional. -RNAt o RNAr: transcrit primari; es fragmenta i s'empalmen els fragments que donaran lloc al RNA definitiu.

La transcripció en eucariotes

5. L'expressió del missatge genètic

Es més complexa que als procariotes (cromatina). Hi ha regions on el DNA esta sempre estès (transcripció contínua). Intervienen nombroses proteïnes reguladores (factores de transcripció) que interactuen amb la RNA-polimerasa. Hi ha tres tipus d'RNA-polimerasa, segons el tipus d'RNA que s'ha de sintetitzar. -RNA-polimerasa I: RNAr -RNA-polimerasa II: RNAm i RNAn -RNA-polimerasa III: RNAt Els gens en eucariotes estan fragmentats de manera que sempre cal un procés de maduració en el qual s'eliminin les seqüències sense sentit, Introns, i s'empalmin les seqüències amb sentit: Exons. La transcripció té lloc en quatre fases: -Iniciació -Allargament o enlogació -Terminació o acabament. -Maduració.

2.- Allargament o elongació:-Síntei continua en sentit 5'-3' - Una vegada s'han transcrits uns 30 nucleòtids s'afegeix a l'extrem 5' unca caputxa de metilguanosina invertida (que protegeix l'ARNm i facilita la seva maduració i traducció). -Un mateix gen pot ser trancrit per diverses RNA-polimerases alhora.

La transcripció en eucariotes

5. L'expressió del missatge genètic

1.- Iniciació:-La RNA-polimerasa II es fixa a la regió promotor del DNA (formant el complex de transcripció). -Els promotors en eucariotes tenen dues regions identificables: seqüència CAAT i regió TATA. -Perquè es pugi fixar la RNA-polimerasa es necessària la intervenció dels factors de transcripció (proteïnes). -Tot el conjunt rep el nom de complex d'inciació de la transcripció.

4.- Maduració:- Es produeix al nucli i la realitza un enzim anomenat ribonucleoprteïna petita nuclear (pnRNP). -Diversos pnRNP formen un complex de tall i unió que eliminarà els introns. -Posteriorment una RNA-lligasa unirà els exons.

La transcripció en eucariotes

5. L'expressió del missatge genètic

3.- Finalització:- Durant la trancripció, la RNA-polimerasa es pot trobar am b una seqüència d'acabament (TTATTT). - Després d'aquesta seqüència s'afegirà una cua de poli-A (adicció catalitzada per l'enzim poli-A-polimerasa) formada per uns 200 ribonucleòtids d'adenina. -Ja està format el pre-mRNA.

Es pot observar que per a alguns aas hi ha diversos triplets. Generalment difereixen en un sol nucleòtid (per exemple, UAU, UAC són Tyr). Aquesta situació s'anomena degeneració de la clau genètica i representa un avantatge, ja que, encara que es produís un error en la còpia d'un nucleòtid, continuaria la col·linearitat entre el triplet i l'aminoàcid. AUG, que codifica para Metionina, met, és el codó d’inici universal en la traducció dels organismes, tant en procariotes com en eucariotes. Indica el lloc on el ribosoma ha de començar la síntesi de la proteïna. UAA, UAG i UGA no codifiquen cap aminoàcid, sinó que actuen com a senyals de finalització de la traducció.

6. El codi genètic

El codi genètic es la clau que relaciona una seqüència polinucleòtidica de RNAm amb una seqüència de les proteïnes.-L'RNA es un polímer lineal de 4 nucleòtids diferents i les proteïnes són polímers de 20 aminoàcids. -El nombre mínim per codificar cada aminoàcid es de tres nucleòtids: 43=64 posibles triplets.

7.1 Activació dels aminoàcids

7. La traducció o biosíntesi de les proteïnes

L'activació és la unió de cada aminoàcid al seu RNAt especific. Intervenen l'enzim aminoacil-tRNA-sintetasa i ATP. El reconeixement de l'aminoàcid per tRNA es dóna gracies a que aminoacil-tRNA sintetases tenen tres llocs d'unió diferents: -reconeixement de l'aminoàcid. -reconeixement del tRNA -reconeixement del ATP Hi ha un aminoacil-tRNA-sintetasa per cada RNAt L'aminoacil-tRNA-sintetaasa es considera un adaptador entre RNAt i l'aminoacid.

1.- Iniciació de la síntesiPer tal que s'inicïï la síntesi és necessària la intervenció d'uns factors d'iniciació i que hi hagi un aport d'energia (GTP). L'RNAm s'uneix a la subunitat petita d'un ribosoma gràcies a una seqüència inicial (regió lider, no traduïda) que té uns deu nucleòtids complementaris a RNAr. El codó d'inici (AUG) s'uneix a l'aminoacil-RNAt que és complementari (UAC) i que s'anomena anticodó, i porta la Met. S'estableixen enllaços d'hidrogen entre els codó i l'anticodó. Finalment, s'afegeix la subunitat gran formant el complex ribosòmic.

7.2 Traducció

7. La traducció o biosíntesi de les proteïnes

Una vegada activats els aminoàcids, continua el procés de biosíntesis de proteïnes als ribosomes. Hi ha tres subetapes: -Iniciació de la síntesi. -Elongació o allargament de la cadena polipeptídica. -Acabament de la síntesis.

7.2 Traducció

7. La traducció o biosíntesi de les proteïnes

En complex ribosòmic o complex actiu es diferencien tres llocs d'unió:-Lloc P o centre peptidil: on es situa el primer aminoacil-RNAt -Lloc A o centre acceptor: on es col·loquen els aminoacils-RNAt següents. -Lloc E o centre de sortida: on es situa el RNAt que ha aportat el seu aminoàcid surt del ribosoma. Aquest procés no és igual a totes les cèl·lules: -Eucariotes: L'RNAm primer ha de madurar. -Procariotes: transcripció i traducció simultàniament. Si el RNAm es molt llarg es poden formar poliribosomes o polisomes, mes d'un ribosoma traduint el mateix RNAm.

7.2 Traducció

7. La traducció o biosíntesi de les proteïnes

2.- Elongació o allargament de la cadena polipeptídica:Després de formar-se el complex d'iniciació es van afegint aminoàcids (segons l'ordre corresponent pels codons del RNAm). Intervenen una sèrie de proteïnes (factors d'elongació). Es donen tres etapes que es repeteixen cíclicament: -Unió del aminoacil-RNAt al lloc A (requereix GTP) -Formació del enllaç peptídic (el primer enllaç es dona entre metionina del el lloc P i l'aminoàcid del aminoacil-RNAt). Ho du a terme l'enzim peptidil-transferasa. -Transposició, El ribosoma es trasllada al nou codó del RNAm i el peptidil-RNAt pasa del lloc A al P.

7.2 Traducció

7. La traducció o biosíntesi de les proteïnes

3.- Acabament de la síntesiVe senyalizada per tres codos especials: UAA, UAG i UGA que no tenen anticodón complementari. També intervenen els factors proteics d'alliberament. -Quan s'afegeix l'últim aminoàcid el polipéptid queda afegit covalentment pel seu extrem carboxil al RNAt (situat en el lloc A del ribosoma) -El polipeptidil-ARNt es separa del ribosoma (factors d'alliberament) -Un enzim peptidil transferasa hidrolitza l'enllaç ester entre la cadena polipeptidica i el RNAt Finalment, el polipèptid, el RNAt i el RNAm es separen del ribosoma i el ribosoma es dissocia (2 subunitats). A mesure que es sintetitza la cadena polipeptídica aquesta va adoptant estructura secundària i terciària.

8. La regulació de l'expressió gènica

Las cèl·lules no estan constantment sintetitzant tots els tipusde proteïnes sobre les quals tenen informació, aixó produiria un caos metabòlic. Així doncs, és evident que ha d'existir un sistema de regulació. El sistema de regulació permet optimitzar els recursos cel·lulars per transcriure i traduir únicament el que es necessita en aquell moment. La quantitat de proteïnes sintetitzades depèn directament de la quantitat d'RNAm present al citoplasma, la quantitat d'RNAm sintetitzat regula els nivells enzimàtics del medi. Per tant, n'hi ha prou que regular la síntesi d'RNAm. L'RNAm es manté funcionl a molt poc temps (l'RNA és inestable) -La quantitat de RNAm determina la quantitat de proteïnes -La síntesi de RNAm regula el metabolisme cel·lular.

8. La regulació de l'expressió gènica

La síntesi de RNAm depèn: -Procariotes: substrat disponible -Eucariotes: concentracions hormonal medi intern (factors reguladors de transcripció). En bacteris es va descobrir el model de control negatiu o de l'operó, i de control positiu o per AMP cíclic (AMPc) El 1961, Jacob i Monod van proposar un model anomenat operó , que explica com s'efectua el control de la biosíntesi proteica. En aquest model es diferencien dos tipus de gens: els gens estructurals i els gens reguladors. Gens estructurals: codifiquen les proteïnes estructurals i les proteïnes enzimàtiques. Gens reguladors: codifiquen les proteïnes que tenen com a missió controlar l'activitat dels gens estructurals. Aquestes proteïnes s'anomenen repressores.

8. La regulació de l'expressió gènica: Funcionament de l'operó.

En l'operó lac de l'Escherichia coli hi ha un sol gen regulador i tres gens estructurals. Aquests es troben contigus i es transcriuen tots alhora. Al costat del primer gen estructural que es transcriu hi ha dues zones específiques: la zona promotora, que és on es fixa l'RNA-polimerasa, i la zona operadora, que és on es fixa el repressor. En l'operó lac, el repressor produït pel gen regulador laci s'associa a la zona operadora i impedeix que l'RNA-polimerasa, que es troba a la zona promotora, transcrigui els gens estructurals. Aquest operó funciona segons el sistema d'inducció enzimàtica, ja que hi ha unes molècules anomenades inductores, que en aquest cas són les molècules de lactosa, que, en associar-se amb els repressor, els provoquen unes alteraciones a l'estructura. A causa d'aixó, aquests repressors perden afinitat per la zona operadora, i l'RNA-polimerasa, com que no troba obstacles per actuar, transcriu els gens estructurals.

8. La regulació de l'expressió gènica

8. La regulació de l'expressió gènica