3.3 Pruebas Diagnósticas

Introducción

Las pruebas diagnósticas de laboratorio son esenciales en la medicina veterinaria, ya que permiten identificar, monitorear y controlar enfermedades en animales, tanto en el ámbito de la salud pública como en la producción animal. La detección temprana de infecciones y trastornos mediante pruebas serológicas, moleculares e inmunológicas es crucial para prevenir brotes epidémicos, mejorar los programas de vacunación y tratar enfermedades de forma eficaz. Este trabajo presenta una tabla comparativa de diversas pruebas de laboratorio utilizadas en la veterinaria las cuales son fundamentales para detectar enfermedades infecciosas, parásitos, trastornos inmunológicos y otros problemas de salud en diferentes especies animales. A través de estas pruebas, nosotros como médicos veterinarios podemos tomar decisiones informadas para garantizar la salud de los animales, así como la seguridad de los productos de origen animal y además de llegar a un diagnóstico clínico.

Tecnica Diagnostica

Tecnica Diagnostica

Tecnica Diagnostica

Tecnica Diagnostica

Tecnica Diagnostica

lisados celulares, muestras de sangre, alimentos saliva,orina o líquido cefalorraquídeo

Suero Sanguineo

Suero Sanguineo

lisados celulares, muestras de sangre, alimentos saliva,orina o líquido cefalorraquídeo

Tecnica Diagnostica

Suero Sanguineo

Sirve para determinar la concentración total de anticuerpos en una determinada muestra de cualquier especie. Frecuentemente empleado para detectar anticuerpos contra VIH .

Útil para detectar antígenos virales específicos, como los del virus del dengue

Para el diagnóstico de la brucelosis de ganadobovino, caprino y porcino de cualquier edad y sexo

Detecta anticuerpos contra virus hemaglutinantes

Diagnóstico de brucelosis en animales como bovinos, ovinos, caprinos, y caninos

Interpretación Elisa

6. Elisa indirecto

5. Elisa directo

4. Rivanol

3. Inhibición de la hemoaglutinación

2. Prueba de tarjeta Brucelosis

Pruebas Diagnosticas

Prueba Diagnostica

Ejemplo de enfermedad/condición y la especie

Muestra solicitada

Fundamentos de la técnica

1. Hemotipificación

La tipificación sanguínea se usa en transfusiones de sangre. En cualquier especie

Suero Sanguineo

Biopsia de tejido mamario canceroso

Tecnica Diagnostica

Tecnica Diagnostica

lisados celulares, muestras de sangre, alimentos saliva,orina o líquido cefalorraquídeo

lisados celulares, muestras de sangre, alimentos saliva,orina o líquido cefalorraquídeo

Ejemplo de enfermedad/condición y la especie

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Sangre

Saliva, orina , liquido cefaloraquideo

Sangre o tejido

Anemia hemolítica en felinos

Estreptoccocosis porcina

Cisticercosis en porcinos

Neoplasias mamarias en Caninos (hembras)

Es mejor para detectar antígenos de pequeño tamaño o presentes en muy bajas concentraciones. Ideal para medir niveles bajos de hormonas tiroideas o drogas en la sangre.

12. Citometria de flujo

11. Pruebas de aglutinacion con particulas de latex

10. Westernblot

9. Inmunohistoquimica

8. Elisa competitivo

Pruebas Diagnosticas

Prueba Diagnostica

Muestra solicitada

Fundamentos de la técnica

7. Elisa sandwich

Elisa que sirve cuando se trata de analizar muestras complejas, sin necesidad de purificar el antígeno previamente.Como Clostridium difficile, detectando toxinas específicas.

Ejemplo de enfermedad/condición y la especie

Técnica diagnostica

Técnica diagnostica

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Sangre, líquido cefalorraquídeo, saliva, secreciones respiratorias y tejidos.

Sangre principalmente, saliva, lagrimas, orina y fluidos corporales

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Suero sanguíneo

Muestras de suero sanguíneo no hemolizado de ovinos, bovinos y caprinos

Muestras de tejido encefálico

Evaluar la respuesta inmune despues de la vacunación de la Rabia en animales de compañia (perros, gatos).

Erliquiosis canina, debe estar infectado, puede o no tener sintomas, se presenta en los perros.

Brucela en bovinos

Brucelosis en bovinos, ovinos y caprinos

Rabia en caninos

18. Titulación de anticuerpos

17. Inmunocromatografia

16. Fijación del complemento Brucela

15. Inmunodifusion en gel Brucela

14. Inmunofluorescencia rabia

Pruebas Diagnosticas

Prueba Diagnostica

Muestra solicitada

Fundamentos de la técnica

13. Electroforesis de proteinas de suero de GAMAPATIAS Y AGAMMAGLOBULINEMIA

Mieloma multiple en caninos

Muestra de sangre

Ejemplo de enfermedad/condición y la especie

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Sangre, líquido cefaloraquídeo, tejidos, saliva y secreciones respiratorias

Sangre venosa, líquido cefalorraquídeo y tejidos

Técnica diagnóstica

Técnica diagnóstica

Sangre (plasma), muestras de tejidos, secreciones, líquidos corporales.

Sangre, líquido amniótico, secreciones respiratorias y tejidos.

Sangre periferíca venosa, plasma, suero, cél. mononucleares, tumorales, epiteliales y endoteliales.

Evaluación de la eficacia de la vacuna contra la influenza en humanos .

Diagnóstico para el virus del Dengue en humanos.

Diagnóstico de tuberculosis en humanos

Evaluación de la respuesta inmune en enfermedades como Lupus

Evaluar la seguridad de nuevos fármacos contra el cáncer

24. Fluorescent Focus Neutralization

23. Plaque reduction neutralization

22. Elispot

21. Prueba de neutralización

20. Prueba de citotoxicidad

Pruebas Diagnosticas

Prueba Diagnostica

Muestra solicitada

Fundamentos de la técnica

19. Prueba de antiglobulina

Anemia hemolitica autoinmunitaria en humanos, se forman anticuerpos contra los globulos rojos propios de la persona.

Sangre venosa (EDTA), plasma, suero, globulos rojos

CONCLUSIÓN

Como médicos veterinarios estamos en constante búsqueda para brindar la mejor atención médica, cabe destacar la relevancia de las pruebas de diagnóstico de laboratorio para un seguimiento y diagnóstico certero de diversas condiciones de salud en nuestro pacientes. Como pudimos aprender de la elaboración del presente, conocemos que las diversas pruebas mencionadas con anterioridad nos proporcionan valiosa información sobre la respuesta inmunológica del paciente ante diversas enfermedades. Estas pruebas desempeñan un papel fundamental en el diagnóstico y monitoreo de infecciones virales, enfermedades autoinmunes y otras condiciones médicas. Cabe mencionar que facilitan la detección temprana de enfermedades, lo que mejora las posibilidades de tratamiento, nos permiten detectar y contener brotes epidémicos así como facilitar la vigilancia de enfermedades infecciosas y autoinmunes. Otro de los aspectos importantes a mencionar es el avance tecnológico de la mayoria de las pruebas, ya que permiten detectar y cuantificar moleculas específicas, detectan anticuerpos y antígenos y nos permiten visualizar estructuras moleculares y celulares, asi como varias de ellas incluyen una interpretación y análisis de los resultados de las pruebas. Para concluir podemos mencionar que estas pruebas de diagnóstico son herramientas fundamentales en la medicina veterinaria moderna, con una importancia clínica y relevancia significativa en la salud. Los avances tecnológicos han mejorado su precisión y accesibilidad, ademas de que los desafíos y oportunidades futuras ofrecen un campo emocionante para la investigacion y desarrollo.

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• Separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel.
• Transferir las proteínas separadas a una membrana.
• Incubar la membrana con un anticuerpo específico para la proteína de interés.
• Detectar la unión entre el anticuerpo y la proteína.

Análisis de laboratorio que detecta la presencia de antígenos o anticuerpos en fluidos corporales, como la saliva, la orina, el líquido cefalorraquídeo o la sangre. se basa en la respuesta inmunitaria del organismo, que produce anticuerpos específicos para combatir un patógeno. La aglutinación se produce cuando se mezclan partículas de látex recubiertas con un anticuerpo o antígeno con una muestra que contiene el antígeno o anticuerpo específico.

Interpretación Elisa

1. Lectura de la absorbancia

• El ELISA mide la cantidad de color generado en la reacción enzimática, que se traduce en valores de absorbancia mediante un lector de microplacas.
• Estos valores se presentan como datos cuantitativos que reflejan la intensidad de la señal óptica en cada pocillo.

2. Uso de controles

• Controles positivos: Ayudan a confirmar que el ensayo funciona correctamente y que los reactivos son eficaces.
• Controles negativos: Permiten identificar el nivel basal de absorbancia y descartar resultados falsos positivos.
• Blanco: Usualmente es un pocillo sin muestra que contiene solo el diluyente o buffer. Sirve para restar cualquier absorbancia de fondo.

3. Cálculo del punto de corte (cut-off)

• El punto de corte se utiliza para determinar si una muestra es positiva o negativa. Se puede calcular según las instrucciones del fabricante o usando fórmulas como:
• Cut-off = Media de los controles negativos + 2 desviaciones estándar.

4. Interpretación cuantitativa o cualitativa

• Cualitativa: Las muestras con absorbancia mayor al punto de corte se consideran positivas, mientras que las menores al punto de corte son negativas.
• Cuantitativa: Si el ensayo incluye una curva estándar (generada con concentraciones conocidas de la sustancia de interés), se puede determinar la concentración de la sustancia en las muestras interpolando los valores de absorbancia en la curva estándar.

• Fijación y corte del tejido
• Revestimiento de la sección
• Incubación con anticuerpos primarios
• Detección de anticuerpos
• Visualización de los resultados
• Análisis de resultados
• Interpretacion de resultados

Analizar la formación de focos fluorescentes

Tinción con anticuerpos fluorescentes

Incubación secundaria de 24-48 hrs.

Agregar células sensibles al virus

Incubación durante 30-60min

Combinar la muestra con el virus

Se hace la dilución serial

Fluorescent Focus Neutralization (FFN)

Se prepara la muestra (suero o muestra biológica)

Se utiliza para el diagnóstico de enfermedades, la evaluación de vacunas, monitoreo de respuestas inmunitarias e investigación de inmunoterapia.

Los anticuerpos se unen a la proteína específica en el tejido y pueden ser detectados mediante una técnica de visualización, como la inmunofluorescencia o inmunoensayo con peroxidasa. Los pasos de una inmunohistoquímica son:

• Fijacion y corte del tejido: extraccion de tejido y fijacion en solucion de formaldehído para evotar degradacion proteica, luego se corta en secciones finas con un microtomo
• Revestimiento de la sección: la seccion cortada se coloca en una laminina y se reviste con una solucion para evitar adherencia no especifica de los anticuerpos
• Incubacion con anticuerpos primarios: se aplican anticuerpos específicos contra la proteína de interés sobre la sección y se incuban para permitir que los anticuerpos se adhieran a las proteínas presentes en el tejido
• Deteccion de anticuerpos: se aplican anticuerpos secundarios conjugados a una enzima o molécula fluorescente para detectar la unión de los anticuerpos primarios al tejido.
• Visualización de los resultados: los anticuerpos unidos se visualizan mediante coloración con un substrato para la enzima o con microscopia fluorescente
• Análisis de resultados: se evalúa la presencia y distribución de la proteína en el tejido y se compara con controles negativos y positivos
• Interpretacion de resultados: se interpretan en el contexto clinico y patologico y se utilizan para establecer un diagnóstico o para evaluar la respuesta terapéutica

Método de laboratorio para determinar el número de células, el porcentaje de células vivas y ciertas características de las células (tamaño y la forma) en una muestra de sangre, médula ósea u otro tejido. También sirve para identificar marcadores tumorales, como antígenos, en la superficie celular. Las células se tiñen con un tinte sensible a la luz, se colocan en un líquido y luego se pasan una a una por un haz de luz. Las mediciones se basan en la manera en que las células teñidas responden a la luz. La citometría de flujo se usa en investigación básica y para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, como el cáncer

Método de laboratorio para el que se usan anticuerpos a fin de determinar si hay ciertos antígenos (marcadores) en una muestra de tejido. Por lo general, los anticuerpos se unen a una enzima o un tinte fluorescente. Una vez que los anticuerpos se unen al antígeno en una muestra de tejido, se activa la enzima o el tinte y se observa el antígeno al microscopio. Este tipo de prueba se usa para diagnosticar enfermedades como el cáncer y también ayuda a diferenciar entre tipos de cáncer.

Positivo: aglutinación Negativo: Ausencia de aglutinación

Directa - Muestra de sangre en un tuboanticoagulante (EDTA) - Agregar 1-2 gotas de antisuero (antiglobulina) - Incubación 15-30 min a 37°C, observar la aglutinación. Indirecta - Mezclar 1-2 gotas de suero con 1-2 gotas de suspensión de globulos rojos conocidos - Agregar antisuero 1-2 gotas Incubación durante 15-30 min a 37° C.

Prueba de antiglobulina

Esta prueba se usa para diagnosticar ciertos trastornos de la sangre en los que el paciente produce anticuerpos contra sus propios glóbulos rojos y plaquetas, tambien se usa para determinar el tipo de sangre.

Test de Rivanol

Pasos:

• consiste en confrontar el suero problema con un colorante de acridina que precipita las inmunoglobulinas de la muestra, principalmente las IgM, quedando en solución solo las IgG, que son las directamente involucradas con la respuesta inmune ante una cepa de campo.
• Enseguida se realiza de manera similar a la prueba de aglutinación en placa utilizando un antígeno específico. Se consideran positivos todos aquellos sueros que presenten reacción de aglutinación completa en cualquiera de sus diluciones.

• Se utilizan microplacas de 96 pocillos fondo en U.
• El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37ºC).
• Las muestras de suero se inactivan en baño termostático para eliminar el complemento natural contenido en la misma. Los sueros se inactivan por 30 minutos en baño termostático a 60-63ºC.
• La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis.
• Una vez retiradas del baño termostático se dejan a temperatura ambiente por 30 minutos para luego conservar en heladera

Suele realizar de forma más cómoda en formato de microtitulación. Para la incubación de suero, antígeno y complemento, se puede utilizar la fijación en caliente o en frío: 37 ± 2°C durante 30 minutos o 5°C ± 3°C durante 14–18 horas.

El ELISA competitivo es una variante más compleja, también conocido como ELISA de inhibición debido al uso de un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo primario.

ELISA COMPETITIVO

Pasos:

• El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
• Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo
• Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo
• Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
• Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia.
• Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de interés presente en la muestra.

En humanos: Diagnóstico de infecciones como Brucelosis (usando antígenos de Brucella), Neumonía por Legionella, Rubéola, y otras infecciones virales y bacterianas. También se utiliza en la identificación de grupos sanguíneos y pruebas de compatibilidad para transfusiones. En ganado: Bovinos: Se emplea para detectar enfermedades como Brucelosis y Leptospirosis. Porcinos: También se utiliza en pruebas para la detección de Brucelosis porcina y otras infecciones. Ovinos y caprinos: Se usa en pruebas de diagnóstico para Brucelosis y Leptospirosis. En aves: Pollos, pavos y otras aves de corral: Se utiliza para detectar enfermedades como Brucelosis aviar, Newcastle, Influenza aviar y otras infecciones virales o bacterianas. En animales de compañía: Perros y gatos: Aunque menos común, la inhibición de aglutinación se puede usar en algunos casos de diagnóstico de enfermedades infecciosas como la Leishmaniasis canina, entre otras.

Muestras solicitadas

• Muestras de tejidos parafinados de neoplasias previamente diagnosticadas por histopatología
• Neoplasias mamaria smixtas benignas o malignas
• Biopsias de piel
• Muestras de bazo, timo, higado, tonsilas, nodulos linfaticos, cerebro, etc.

Las muestras para inmunohistoquímica (IHC) pueden prepararse como secciones de parafina o secciones congeladas. La preparación de las muestras para IHC implica: Fijar el tejido, Embeber el tejido en parafina o congelarlo, Cortar el tejido en secciones finas, Tratar las secciones con anticuerpos específicos.

• Atemperar las muestras y los reactivos a temperatura ambiente.
• Depositar la muestra y las gotas de los controles positivo y negativo en círculos distintos de un porta.
• Homogeneizar el reactivo de látex y depositar una gota junto a cada una de las muestras.
• Mezclar las gotas con un palillo y extender la mezcla por toda la superficie del círculo.
• Colocar el porta en un agitador rotatorio a 80–100 revoluciones por minuto y agitar durante 2 minutos

Inmunocromatografía. Pruebas de SNAP

Una solución antigénica pasara a traves de una banda porosa, mientras fluye la solución:1. Se encuentra primero con el anticuerpo marcado destacado, al que solubiliza y forma inmunocomplejos ( se tiñe rojo o azul). 2. Pasa a la zona de detección donde que contiene el anticuerpo frente al antígeno y se inmoviliza en la tira porosa que caotura inmunocomplejos.

Positivo: se teñira del color predeterminado en la zona de detección y la zona de control Negativo: Solo se teñira la zona de control

Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo que permite amplificar la señal obtenida. En este caso se utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, y es este último el que irá conjugado a una enzima.

ELISA INDIRECTO

Pasos:

• El antígeno se inmoviliza sobre una placa
• Se añade un anticuerpo primario sin marcar que se une al antígeno de interés
• Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario
• Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.

Inhibición de Aglutinación

Pasos:

• Toma la muestra de suero del animal o persona que se está evaluando.
• Coloca una pequeña cantidad del suero a analizar en una placa de microtitulación o en tubos de ensayo.
• Añade a cada muestra el antígeno específico que deseas probar (por ejemplo, una suspensión de células, látex o una proteína recubierta con el antígeno).
• Incuba la mezcla a una temperatura adecuada (generalmente entre 25 y 37°C) durante 20 minutos para permitir que los anticuerpos en el suero reaccionen con el antígeno.
• Añade partículas (por ejemplo, partículas de látex recubiertas con el antígeno específico) a la mezcla. Las partículas tienen la capacidad de aglutinarse si los anticuerpos correspondientes están presentes en el suero
• Si los anticuerpos del suero están presentes, se uniran a las partículas del antígeno, bloqueando la aglutinación.
• Si los anticuerpos del suero no están presentes , las partículas sensibilizadas se aglutinarán

ResultadosPositivos: título ≥ 0.5 UI/mL

Se hace una incubación secundaria de 48-72hrs

Se añaden células sensibles al virus

Incubación: durante 30min a 37°C

Se mezcla cada dilución con el agente infeccioso (Ejemplo: virus de la rabia)

Se Se realizan diluciones seriadas del suero (1:5, 1:10, 1:20)

Titulación de anticuerpos

Determina la concentración de anticuerpos neutraizantes en suero o plasma.

La muestra se centrifuga para obtener el suero.

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Resultados: se debe incluir la concentración inhibitoria 50 (CI50) para cada sustancia, el % de cél. muertas o dañadas.

Procedimiento - Preparación: se selecciona la célula objetivo(linfocitos, hepatocitos, etc.), se preparan los reactivos. - MTT: Se siembran células en placas de 96 pozos, se agrega la sustancia química a diferentes concentraciones, incubacion de 24-48hrs, se agrega MTT, se incuba de 3-4 hrs y se mide la absorbancia.

Pruebas de citotoxicidad

El daño que causa el complemento no solo a la membrana, si no tambien a células nucleadas y de los protozoos, se puede determinar por meio de los anticuerpos frente antígeno de superficie celular mediante la reacción de las células diana.

Existen varios tipos- Prueba de MTT que evalua la viabilidad celular - Prueba de MTS -Prueba de apoptosis

El ELISA directo es el ensayo ELISA más simple y rápido de todos, donde un anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá directamente al antígeno de interés permitiendo la detección y/o cuantificación del mismo.

ELISA DIRECTO

Pasos:

• El antígeno se inmoviliza sobre una placa
• Se añade un anticuerpo primario marcado con una enzima que se unirá al antígeno de interés
• Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.

Procedimiento:- Preparación de la muestra (suero o muestra biológica). - Diluir la muestra en proporciones conocidas - Mezclar la muestra con el virus. - Incubación de 30-60min. - Agregar células sensibles al virus. - Incubación secundaria por 48-72 hrs. - Realizar el conteo de las placas y hacer el cáluculo de reducción.

Plaque reduction neutralization (PRN)

Se utiliza para evaluar la respuesta inmune contra virus, determinar la eficacia de las vacunas, identificar anticuerpos neutralizantes.

Tipos- Directo -Indirecto - Competitivo

El resultado positivo o negativo, se puede dar en porcentaje o con unidades.

Se analiza el resultado mediante microscopía o lectores automatizados.

Se añaden anticuerpos detectores. Revelado con enzimas y sustratos.

Incubación de 24-48hrs

Se estimula con antígenos especificos

Se realiza un aislamiento de células inmunitarias (linfocitos)

ELISpot

Se utiliza para diagnósticar enfermedades infecciosas, monitoreo de respuestas inmunitarias, respuestas inmunitarias en transplantes. Hay tres tipos: de citocinas, anticuerpos y de células.

Obtener muestras de sangre o tejidos

La prueba se basa en la aglutinación visible de antígenos de Brucella cuando estos entran en contacto con anticuerpos específicos presentes en el suero del paciente o animal sospechoso.

Prueba de Tarjeta Brucelosis (Rosa de Bengala)

Pasos:

• Se toma una muestra de sangre del animal
• La muestra de sangre se centrifuga para separar el suero o el plasma,
• Depositar 30µL de suero problema sobre cada cuadrante de la lámina de vidrio.

• Mezclar el suero y el antígeno, formando una zona circular u ovalada de aproximadamente 2cm de diámetro.
• Marcar un temporizador de 4 minutos.
• Levantar la placa y realizar movimientos rotatorios (10-12 por minuto).
• Transcurrido el tiempo proceder a la lectura, sobre fondo blanco. El resultado de la lectura del diagnóstico se informa como positivo o negativo.
• Las reacciones positivas presentan grumos de aglutinación que pueden ser grandes o pequeños y las negativas tienen ausencia de éstos.

Conocer el tipo sanguíneo antes de realizar una transfusión es esencial para evitar reacciones adversas graves, como la hemólisis aguda.

Tipos de sangre en algunas especies

Hemotipificación

Pasos:

• Se toma una muestra de sangre del animal, generalmente de una vena y en cantidad suficiente para realizar las pruebas necesarias.
• La muestra de sangre se centrifuga para separar el suero o el plasma, que es donde se encuentran los anticuerpos y antígenos que determinarán el grupo sanguíneo del perro.
• Se realizan pruebas de aglutinación utilizando sueros que contienen anticuerpos específicos contra los antígenos sanguíneos caninos conocidos o depende la especue que se va a muestrear. Estas pruebas permiten identificar qué antígenos están presentes en la superficie de los glóbulos rojos del perro.
• Dependiendo de los resultados de las pruebas de aglutinación, se determina el grupo sanguíneo del animal
• Es importante mantener registros precisos de la tipificación sanguínea del perro, incluyendo su grupo sanguíneo y cualquier otra información relevante, como la presencia de anticuerpos irregulares.

• Se deben fijar frotis de impresión preparados a partir de una muestra compuesta de tejido encefálico, que incluya el tronco del encéfalo y el cerebelo.
• Estos frotis se fijan en acetona fría de grado alto al 100% (–20°C) durante al menos 20 minutos o se fijan por calor pasando el porta 2–3 veces por una llama. Se secan al aire y después se tiñen con conjugado de anticuerpo policlonal o monoclonal anti-rabia marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína), diluido a concentración de trabajo y en una cantidad suficiente como para cubrir todo el porta, durante 30 minutos a 37°C en una caja húmeda.
• Los portas problema para la FAT deben examinarse para comprobar si presentan fluorescencia específica, empleando un microscopio de fluorescencia invertido y un filtro apropiado para la longitud de onda (490 nm y re-emite a 510 nm).
• Se identifican agregados de proteína de la nucleocápsida mediante fluorescencia específica de conjugado unido.

Los sitios antigénicos conservados en las proteínas de la nucleocápsida permiten la identificación de todos los lyssavirus con preparaciones comerciales modernas de conjugados de anticuerpos policlonales anti-rabia que se emplean para pruebas diagnósticas en tejido encefálico, mientras que los conjugados de anticuerpos monoclonales anti-rabia pueden tener poca sensibilidad para la detección de varios lyssavirus. Los conjugados de anticuerpos fluorescentes, en concreto los generados a nivel local, deberán validarse por completo respecto a la especificidad y sensibilidad antes de ser utilizados.

En el ELISA tipo sándwich el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro de detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a dos epítopos distintos de un mismo antígeno.

ELISA SANDWICH

Pasos:

• El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa
• Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al anticuerpo de captura
• Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su vez al anticuerpo de captura.
• En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima, procederemos directamente con el 5º paso. En caso contrario (que es lo más habitual en los ELISA tipo sándwich), será necesario añadir un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo de detección.
• Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de interés.

Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o químico.

Procedimiento- Preparación: se selecciona la cepa viral o bacteriana, se prepara la muestra, se selecciona un método de prueba y la preparación de los reactivos. - Se siembran células susceptibles en placas de 96 pozos - Se agrega la cepa viral y la muestra - Incubación de 24-48hrs - Se evalua la inhibición de la replicación viral - Calcular la concentración inhibitoria 50.

Pruebas de neutralización

Tipos de neutralización- viral - bacteriana - toxinas