Presentazione Culture in vitro 2° lezione

* tratto da materiale Università Mediterranea https://www.unirc.it/documentazione/formazione/materiale/Quinta_lezione_bis.pdf

Le culture in vitro*

Lezione teorica sulle basi, applicazione e finalità di questa biotecnologia

Info

Per coltura in vitro s’intende l’applicazione bio-tecnologica in cui cellule, tessuti e organi sono coltivati in un ambiente sterile ed artificiale ed in condizioni chimico­-fisiche controllate.

La tecnica delle colture in vitro nei vegetali ebbe inizio nei primi anni del 1900 ad opera di Haberlandt il quale, basandosi sul concetto di TOTIPOTENZA, riprese e ampliò la teoria cellulare formulata 60 anni prima da Schwann e Schleiden

Pianta completa”

Processo di “ ri-differenziazione”

La base delle tecniche di coltura in vitro è proprio la totipotenza delle cellule vegetali. Cellule e/o tessuti DIFFERENZIATI hanno la capacità di rigenerare un individuo completo infatti e cellule mature, altamente specializzate, mostrano la capacità di regressione verso uno stato meristematico, indifferenziato. Si avrà quindi Processo di “ de-differenziazione

In condizioni asettiche e con:

• pH
• luce
• temperatura

• specifici terreni di cultura
• fonti di carbonio
• vitamine
• sorgenti di azoto

In adeguate condizioni colturali, la cellula vegetale embrionale può sviluppare la pianta intera

Queste sono le tecniche utilizzate per mantenere e crescere tessuti e organi vegetali in coltura sterile. Tali tecniche sono integrative e non alternative alle tecniche tradizionali di propagazione clonale.

Tecniche di Coltura in vitro

La coltura in vitro ha contribuito: 1. a far luce sui processi biochimici, fisiologici e genetici che regolano lo sviluppo e la riproduzione delle piante 2. alla messa a punto di numerose tecniche, definite tecniche di colture “ in vitro” , che hanno permesso sviluppi eccezionali nei processi della produzione vegetale.

Schema sintetico delle tappe che caratterizzano le colture in vitro sia su terreno solido che liquido.

Caratteri della tecnica delle colture “ in vitro”

• piccole dimensioni degli espianti; • la coltivazione in ambienti asettici; • le condizioni ambientali controllate; • il rispetto di alcuni fattori chimici come gli elementi minerali nutritivi e sostanze ormonali.

La tecnica delle colture “ in vitro” consente

1. riprodurre sistemi biologici complessi in ambienti ristretti e tempi limitati, in condizioni ambientali (luce, temperatura, umidità ecc.) e nutrizionali (composizione dei terreni di coltura) strettamente controllati. 2. avere sempre materiale vegetale disponibile, svincolando le osservazioni dalla stagionalità e dalla durata del ciclo vegetativo 3. Ottenere uno screening veloce di selezione del germoplasma 4. Manipolare il corredo genetico, favorendo l’introduzione di geni e ottenendo cloni transgenici resistenti 5. realizzare e gestire collezioni clonali garantendo la conservazione di prezioso patrimonio genetico

Tecnica propagazione asessuata che permette, partendo da una pianta madre, di ottenere un numero elevato di cloni identici alla pianta di partenza. Si basa sulla capacità di un meristema (apice proliferativo di un germoglio o di una gemme dormiente) di accrescersi continuamente e di produrre un germoglio (1 apice 100­-370 piante)

Focus tecniche di micropropagazione

• Risanare materiale da virus e allevare materiale virus ­esente

• Applicare questa tecnica all’industria vivaistica per quelle specie che sono difficili da propagare

• Svincolarsi dalle variazioni stagionali e dal tempo

• Ottenere materiale vegetativo uniforme e con una crescita più rapida e vigorosa

• Ottenere materiale vegetativo esente da patogeni quali funghi e batteri

• Ottenere in tempi relativamente brevi un numero elevato di piante, capaci di essere stoccate in piccoli spazi

Vantaggi della tecnica

• Intenso e complesso lavoro manuale
• Non esistono protocolli standard per tutte le specie
• Alcune specie sono recalcitranti
• I cloni possono avere ancora costi eccessivi (5 volte rispetto a pianta convenzionale)

Limiti della tecnica

Acclimatazione

Moltiplicazione del materiale vegetale

Fasi della micropropagazione

Timeline

Raccolta del materiale

Induzione e stabilizzazione della coltura

Radicazione

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1. Il materiale raccolto è sterilizzato con soluzioni di ipoclorito di sodio o di calcio, lasciandolo in immersione per un tempo differente a seconda del tipo di tessuto e/o di pianta 2. il materiale vegetale sterile è posto in un terreno di coltura agarizzato addizionato di nutrienti e di regolatori di crescita quali auxina (IBA, 6­BA) e citochinina (NAA, 2,4­ D), che permettono all’apice del germoglio di allungarsi e di sviluppare delle gemme laterali da cui si originano germogli avventizi. 3. La coltura è effettuata in camera di crescita in condizioni di temperatura ed illuminazione controllate

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Bassa percentuale di sopravvivenza delle piantine

Acclimatazione

È il processo attraverso il quale le “ plantule” ottenute in vitro sono trasferite in condizioni di coltura ex vitro. Il passaggio da stato di semi­eterotrofia → stato di assoluta autotrofia è traumatico: si verificano infatti condizioni di

• minore umidità
• maggiore intensità luminosa
• oscillazione termica
• mancanza di condizioni asettiche

Per evitare l’alta mortalità delle piantine esse

• sono trasferite in apposti vasi contenenti torba e perlite,
• sono mantenute con la parte aerea coperta da un tunnel plastico (tunnel di acclimatazione), capace di garantire un’elevata umidità.

1. Le prime foglie si adattano a questo ambiente; 2. le foglie vecchie provvedono a costruirsi una cuticola cerosa superficiale che le protegge dalle perdite di acqua e dalla disidratazione Terminata questa fase, le piante possono essere trasferite in pieno campo.

Prossimo incontro del 14 novembre al CREA di Sanremo Corso Inglesi 508, per le attività di laboratorio

grazie per l'attenzione

I terreni più utilizzati sono:

• MS (Murashige and Skoog),
• GD (Greshoff y Doy),
• H53 o HM (Heller o Heller modificato)

Gli ormoni hanno la funzione di regolare e indirizzare i processi organogenetici o di differenziamento e la crescita degli espianti.