Módulo Didáctico STEM

Niko Alain Cruz Sancén

Proteómica

Estructura

Cuantificación

Secuenciación

Caracterización

Análiis y Validación

Purificación

ObjETIVOS

ÍNDICE

Proteómica

Definición

Proteómica

Definición

Proteómica

La proteómica es la evaluación completa de la estructura y la función de las proteínas para comprender la naturaleza de un organismo. La espectrometría de masas es una herramienta esencial que se utiliza para perfilar las proteínas en la célula. Sin embargo, el descubrimiento de biomarcadores sigue siendo el mayor desafío de la proteómica debido a su complejidad y dinamismo. Esta revisión destaca los tipos de proteómica, las técnicas proteómicas disponibles y sus aplicaciones en diferentes campos de investigación.

Virág, D., Dalmadi-Kiss, B., Vékey, K., Drahos, L., Klebovich, I., Antal, I., & Ludányi, K. (2019). Current Trends in the Analysis of Post-translational Modifications. Chromatographia, 83(1), 1–10. https://doi.org/10.1007/s10337-019-03796-9 ‌

Genoma dinámico.

Proteómica

Clasificacióny Aplicaciones

Proteómica

Purificación de Proteínas

Exclusión por tamaño

Afinidad

Intercambio Iónico

Técnica de laboratorio para la separación de una mezcla en sus componentes. La mezcla se disuelve en un disolvente fluido (gas o líquido) llamado fase móvil , que la transporta a través de un sistema (una columna, un tubo capilar, una placa o una lámina) en el que se fija un material llamado fase estacionaria.

Purificación de proteínas: Cromatografía

Análisis y validación de proteínas

ELISA

Western-Blot

Microarreglos proteínas

Análisis y validación de de Proteínas

Caracterización de proteínas

Espectometría de masas

Técnicas basadas en gel

INFO

INFO

Caracterización de proteínas

Secuenciación de proteínas

• Identifica un aminoácido de una cadena peptídica.
• Se "marca" el residuo (aminoácido), en su extremo N-terminal con isotiocianato de fenil.
• Se disminuye el pH y separa el aminoácido marcado.
• Se obtiene la secuencia de aminoácidos 1 a 1.
• La limitante es que máximo se puede hacer en bloques de 50 a 60 residuos.

Secuenciación Edman

Cuantificación de proteínas

ICAT

SILAC

iTRAQ

cUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Análisis estructural de proteinas

Resonancia Magnética nuclear

Cristalografía de rayos x

Proteómica estructural

quiz

Western BLOT

icat

SUBTítulo aquí

pregunta I

ELISA

¿Cuál de estas técnicas marca específicamente residuos de cisteína en las proteínas?

MALDI-TOF

2D-PAGE

SUBTÍTULO Aquí

PREGUNTA II

ELISA

¿Técnica utilizada para la identificación de proteínas específicas, a través de una reacción mediada por la unión antígeno anticuerpo?

Western-BLORT

iTraq

CG-MS

Para la determinación del proteoma y/o el metaboloma asociado a una condición, ¿Cuál sería la herramienta apropiada si el objetivo es caracterizar el conjunto completo de moléculas conocidas e incluso desconocidas para nosotros?

pregunta IIi

Western-BLOT

Espectometría de masas

ITRAQ

Técnica que permite identificar proteínas específicas, por medio de la unión antígeno anticuerpo y analizado el resultado en cuestión a su masa y cantidad presente en un gel de acrilamida

subtítulo aquí

pregunta Iv

módulo didáctico

¡leccion terminada!

iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)

Utiliza etiquetas isobáricas para marcar múltiples muestras de proteínas, lo que permite comparar varias condiciones experimentales simultáneamente. Es una técnica multiplex altamente eficiente para la cuantificación relativa y absoluta de proteínas.

ELISA

ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ‘ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas’) es una técnica en la cual se detecta un antígeno inmovilizado mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable.

Técnicas basadas en gel

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)

• La SDS-PAGE es una técnica de alta resolución que separa proteínas según su tamaño molecular.
• El SDS desnaturaliza las proteínas y les confiere una carga negativa uniforme, permitiendo su separación en un gel de poliacrilamida por tamaño. Esta técnica es esencial para determinar el peso molecular aproximado de las proteínas.

La electroforesis en gel bidimensional (2D-PAGE).

• Es una técnica eficaz para separar proteínas según su carga y masa molecular, permitiendo la resolución de miles de proteínas en una única corrida de gel.
• En la primera dimensión, las proteínas se separan por su punto isoeléctrico, y en la segunda por su tamaño molecular.
• Es comúnmente utilizada para investigar modificaciones postraduccionales, proteínas mutantes y rutas metabólicas.

Cromatografía Intercambio iónico

En la cromatografía de intercambio iónico, el soporte está compuesto por pequeñas perlas que se unen a sustancias químicas con carga. Cada molécula cargada presenta un contraión.

(FIG. 3. Western Blot Analysis for IRS-1-P (Tyr612) And..., 2020)

• Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido.
• El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra.
• Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana.
• La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la proteína en estudio.
• La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o químico.

Western Blot

(SILAC Metabolic Labeling Systems | Thermo Fisher Scientific - MX, 2024)

Etiquetado metabólico con isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC)

Es un método robusto y eficiente para la proteómica cuantitativa basada en espectrometría de masas (MS). El método SILAC utiliza una estrategia de etiquetado metabólico para incorporar aminoácidos "pesados" etiquetados con 13C o 15N in vivo en las proteínas durante la traducción. Puede aplicarse ampliamente para la identificación, caracterización y cuantificación exhaustivas de proteínas, así como para el descubrimiento de biomarcadores complejos.

Margaret Dayhoff: Madre y Padre a la vez

Margaret Dayhoff (1925-1983) fue una fisicoquímica que resolvió el problema de la secuenciación de proteínas, a través de la informática. Creó COMPROTEIN (1960´s)

Isotope-coded affinity tag (ICAT)

ICAT es una herramienta en proteómica que emplea un reactivo con tres partes:

1. una que se une a las proteínas por la cisteína,
2. otra que las diferencia por su masa (gracias al deuterio)
3. una última (biotina) que permite aislarlas.

Esto ayuda a identificar y cuantificar proteínas específicas, fundamental en el estudio de enfermedades.

F.X. Reymond Sutandy, Qian, J., Chen, C., & Zhu, H. (2013). Overview of Protein Microarrays. Current Protocols in Protein Science, 72(1). https://doi.org/10.1002/0471140864.ps2701s72 ‌

Microarreglo de proteínas

Un microarray de proteínas (o chip de proteínas ) es un método de alto rendimiento utilizado para rastrear las interacciones y actividades de las proteínas, y para determinar su función, y determinar la función a gran escala. Su principal ventaja radica en el hecho de que se pueden rastrear grandes cantidades de proteínas en paralelo.

(Kumari et al., 2021)

Cromatografía por afinidad

La cromatografía de afinidad es una técnica de separación basada en la afinidad en la que los componentes de una mezcla se separan en función de su afinidad hacia una etiqueta/enlazador especial asociado a la fase estacionaria del sistema

Cromatografía por exclusión de tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño , también conocida como cromatografía de tamiz molecular, es un método cromatográfico en el que las moléculas en solución se separan por su forma y, en algunos casos, por su tamaño .

Variantes acorde a tipo de ionización

• Ionización por electrospray (ESI)
• Ionización por electrospray de desorción (DESI)
• Desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) con tiempo de vuelo (TOF), Aka. MALDI-TOF.

Espectometría de Masas (MS)

La espectrometría de masas es una técnica analítica que mide la relación masa-carga de iones. Los resultados se visualizan en un espectro de masas, un gráfico que muestra la intensidad de los iones en función de su relación masa-carga. Esta técnica se emplea en diversos campos para identificar compuestos, determinar estructuras moleculares y analizar muestras, tanto puras como complejas. Un espectro de masas proporciona información valiosa sobre la composición elemental, las masas de partículas y moléculas, y la identidad química de sustancias.