Il DNA

Le caratteristiche del genoma eucariote

Le mutazioni sono cambiamenti del DNA

Le caratteristiche del genoma procariote

La trascrizione: dal DNA all'RNA

La traduzione: dall'RNA alle proteine

L'informazione passa dal DNA alle proteine

La replicazione del DNA

IL DNA

• i nucleotidi liberi si uniscono a ciascun nuovo filamento in crescita seguendo l'appaiamento per complementarità con le basi del filamento stampo. La formazione dei legami fosfodiesterici è catalizzata dall'enzima DNA polimerasi.

• la doppia elica del DNA, con l'aiuto di specifici enzimi, si despiralizza e si rompono i legami a idrogeno tra basi appaiate.

La conferma che il DNA si replica attraverso una replica semiconservativa si ebbe grazie agli studi dei genetisti Matthew Meselson e Franklin Stahl nel 1957. La replicazione avviene in due tappe:

Dopo che i filamenti sono stati separati, le proteine leganti il singolo filamento si legano ai filamenti svolti per impedire che si riassocino in una doppia elica.

Il primo evento è lo svolgimento e la separazione (denaturazione) dei filamenti di DNA. Un gruppo di proteine, la topoisomerasi, agiscono modificando l'avvolgimento della molecola di DNA e consentendone il rilassamento. Successivamente l'enzima chiamato DNA elicasi utilizza l'energia ottenuta dall'idrolisi dell'ATP per separare i due filamenti rompendo i legami deboli che li tengono uniti.

Le telomerasi possono essere importanti nella lotta contro il cancro. Questo enzima è presente in oltre il 90% delle cellule tumorali umane ed è indispensabile a queste cellule peer dividersi in modo continuo. La telomerasi rappresenta un bersaglio promettente per i farmaci antitumorali.

Come abbiamo visto, la replicazione del filamento lento avviene per aggiunta dei frammenti di Okazaki ai primer di RNA. Di conseguenza, a ogni divisione cellulare, il cromosoma si accorcia. Per questo motivo alle estremità dei cromosomi, chiamate telomeri, a ogni ciclo di replicazione del DNA e divisione cellulare, il DNA telomerico può perdere da 50 a 200 coppie di basi; perciò, dopo 20-30 divisioni, i cromosomi non sono più capaci di partecipare alla divisione cellulare, e la cellula muore. La perdita dei telomeri spiega in parte perchè le cellule non durano per tutta la vita dell'organismo. Eppure alcune cellule che continuano a dividersi, come le cellule staminali del midollo osseo e le cellule produttrici dei gameti, conservano il loro DNA telomerico: in queste cellule esiste un enzima, la telomerasi, che catalizza l'aggiunta della sequenza telomerica eventualmente persa.

Crick suggerì l'ipotesi dell'adattatore: deve esistere una molecola adattatrice capace di legarsi in modo specifico a un aminoacido e di riconoscere una sequenza di nucleotidi. Tale molecola adattatrice è poi stata trovata: si tratta dell'RNA transfer, o tRNA. Dato che riconosce il messaggio genetico dell'mRNA e allo stesso tempo trasporta specifici amminoacidi, il tRNA è in grado di tradurre il linguaggio del DNA in linguaggio delle proteine.

Il gruppo di Crick propose che da un filamento di DNA di un particolare gene si formasse per copia complementare una molecola di RNA. L'RNA messaggero o mRNA si sposta poi dal nucleo di citoplasma dove, a livello dei ribosomi, serve da stampo per la sintesi delle proteine. Il processo con cui si forma questo RNA di chiama trascrizione.

La traduzione e l'ipotesi dell'adattamento

La trascrizione e l'ipotesi del messaggero

Una volta definita la struttura del DNA, molti scienziati spostarono la loro attenzione sui processi che consentirono di passare dal DNA alle proteine.

• RNA ribosomiale (rRNA), entra a far parte dei ribosomi e permette di realizzare la sintesi proteica.

• RNA transfer (tRNA), porta gli aminoacidi ai ribosomi e li colloca nella posizione corretta;

• RNA messaggero (mRNA), copia delle informazioni di un tratto di DNA ai ribosomi;

Esistono numerose classi di RNA:

dell'RNA è l'uracile (U).

1. Generalmente l'RNA è formato da un unico filamento;2. La molecola di zucchero che si trova nell'RNA è il ribosio, anziché il desossiribosio del DNA; 3. Tre basi azotate (adenina, guanina e citosina) dell'RNA sono le stesse del DNA, ma la quarta base

L'RNA (acido ribonucleico) è simile al DNA, ma differisce per tre aspetti:

L'inizio richiede un promotore, una speciale sequenza di DNA alla quale si lega molto saldamente l'RNA polimerasi

Il processo di trascrizione è suddiviso in tre stadi:

• inizio,
• allungamento
• terminazione.

La configurazione di una molecola di tRNA è perfettamente adattata alle interazioni con speciali siti di legame sui ribosomi. All'estremità 3' di ogni molecola di tRNA

• "si carica" di un amminoacido;
• si associa alle molecole di mRNA;
• interagisce con i ribosomi.

La traduzione dell'mRNA in proteine richiede una molecola che metta in relazione l'informazione contenuta nei codoni dell'mRNA con specifici amminoacidi delle proteine. Questa funzione è svolta dal tRNA; svolge tre funzioni:

Verso la metà della sequenza del tRNA c'è un gruppo di tre basi, chiamato anticodone, che costituisce il sito di appaiamento fra basi complementari.

si trova un sito di attacco per l'aminoacido.

• Nel sito A l'anticodone del tRNA carico si lega al codone dell'mRNA, allineando l'amminoacido che va aggiunto alla catena polipeptidica in crescita.
• Nel sito P il tRNA cede il proprio amminoacido alla catena polipeptica in crescita.
• Nel sito E viene a trovarsi il tRNA che ha ormai consegnato il proprio amminoacido, prima di staccarsi dal ribosoma, tornare nel citosol e raccogliere un'altra molecola di amminoacido per ricominciare il processo.

Un ruolo determinante nella sintesi proteica è svolto dai ribosomi, strutture complesse in grado di assemblare correttamente una catena polipeptidica, trattenendo nella giusta posizione l'mRNA e i tRNA carichi. Ogni ribosoma è costituito da due subunità, una maggiore e una minore che si uniscono solo durante la traduzione. Sulla subunità maggiore del ribosoma si trovano tre siti di legame per i tRNA. Un tRNA carico scorre tra un sito e l'altro seguendo un ordine preciso.

Dopo che il tRNA caricato con metionina si è legato all'mRNA, la subunità maggiore del ribosoma si unisce al complesso. A questo punto il tRNA caricato con metionina scorre nel sito P del ribosoma, mentre il sito A si allinea al secondo codone dell'mRNA.

Come la trascrizione, anche la traduzione avviene in tre tappe:

• inizio,
• allungamento,
• terminazione.

La traduzione dell'mRNA incomincia con la formazione di un complesso di inizio, costituito da un tRNA caricato con il primo amminoacido della catena polipeptidica e da una subunità ribosomiale minore, entrambi legati all'mRNA.

L'allungamento procede e nel sito A rimasto libero entra il tRNA carico, il cui anticodone è complementare al secondo codone dell'mRNA. Quindi la subunità maggiore catalizza due reazioni:

• nel sito P rompe il legame fra il tRNA e il suo amminoacido,
• catalizza la formazione di un legame peptidico fra questo amminoacido e quello attaccato al tRNA situato nel sito A.

Dopo aver consegnato la propria metionina, il primo tRNA si sposta nel sito E, quindi si stacca dal ribosoma e torna nel citosol per caricare con un'altra metionina. Il secondo tRNA, che ora porta un dipeptide, slitta nel sito P, mentre il ribosoma si sposta di un codone lungo l'mRNA.

La terminazione avviene quando nel sito A entra uno dei tre codoni di stop: il ciclo di allungamento si arresta e la traduzione ha termine. Questi codoni, UAA, UAG e UGA, non codificano nessun amminoacido e non si legano a un tRNA, ma a un fattore di rilascio che consente l'idrolisi del legame fra la catena polipeptica e il tRNA nel sito P. A questo punto il polipeptide appena terminato si separa dal ribosoma.

A mano a mano che emerge dal ribosoma, la catena polipeptidica si ripiega fino ad assumere la sua forma tridimensionale. Oltre a questa informazione strutturale, la sequenza amminoacidica di un polipeptide può contenere una sequenza segnale, una specie di "etichetta con l'indirizzo" che indica il punto della cellula dove dirigersi.

1. Tali proteine sono spedite nel nucleo, nei mitocondri, nei plastidi oppure rimangono nel citosol; 2. Una volta completata la propria sintesi all'interno del RER, queste proteine possono rimanere nel reticolo endoplasmatico oppure raggiungere l'apparato di Golgi. Da lì potranno poi essere spedite ai lisosomi, alla membrana plastica;

L'informazione contenuta negli amminoacidi di ogni proteina fornisce due serie di istruzioni supplementari.

• Una mutazione con acquisto di funzioni produce una proteina con una funzione alterata.

Questo tipo di mutazione è comune nei tumori; per esempio, ci sono mutazioni che stimolano costantemente e in modo incontrollato la divisione cellulare.

• Una mutazione con perdita di funzioni danneggia la funzione della proteina

• Una mutazione silente non ha effetto sulla funzione delle proteine; le mutazioni silenti sono comuni e forniscono una variabilità genetica negli organismi;

Alcune mutazioni hanno effetto sulle proteine e sulle loro funzioni, altre no.

1. Le mutazioni somatiche, per esempio una mutazione in una singola cellula epiteliale umana può produrre una chiarezza cutanea, che però non verrà trasmessa ai figli. 2. Le mutazioni nella linea germinale, con la fecondazione, un gamete contenete una mutazione la trasmette al nuovo organismo.

Negli organismi pluricellulari si riconoscono due tipi di mutazioni

Talvolta esse riguardano singole coppie di basi che si inseriscono nel DNA oppure vengono rimosse e mandano fuori registro il messaggio genetico, alterandone la decodifica.

Le mutazioni per scorrimento della finestra di lettura

Hanno effetto più distruttivo; la sostituzione della base fa sì che nell'mRNA risultante si formi un codone di stop, come per esempio UAG: porta alla sintesi di una proteina più breve non attiva.

Alcune sostituzioni di base modificano il messaggio genetico; un esempio è l'allele responsabile di un tipo di anemia, dovuto a un difetto nell'emoglobina.

Le mutazioni non di senso

Le mutazioni di senso

Mutazioni Puntiformi

Le mutazioni sono cambiamenti nella sequenza nucleotidica del DNA, le possiamo dividere in tre categorie: puntiformi, cromosomiche e del cariotipo

Quando un segmento di DNA si distacca dal proprio cromosoma e va a inserirsi in un cromosoma diverso

Traslocazione

Può essere il risultato della rottura di un cromosoma, seguita da un ricongiungimento errato

Inversione

Un segmento di DNA conterrà due copie

Duplicazione

Rimuove parte del materiale genetico; le sue conseguenze possono essere gravi

Delazione

Mutazioni cromosomiche

Mutazioni cariotipiche Le mutazioni cariotipiche si verificano quando un organismo presenta dei cromosomi in più o in meno rispetto al normale. Se sono presenti interi corredi cromosomici in più o in meno si parla di euploidia aberrante, se invece è solo una parte del corredo cromosomico a essere in eccesso o in difetto, l'anomalia è chiamata aneploidia. Aneploidia più frequenti sono la mancanza di un cromosoma da una coppia di omologhi (monosomia) oppure la presenza di un cromosoma in più in una coppia (trisomia). Il caso più frequente è la trisomia 21, chiamata sindrome di Down.

La delezione di un intero cromosoma X causa la sindrome di Turner, con nascita di femmine X0, corrispondente sindrome di Klinefelter deriva invece da una non-disgiunzione e porta alla nascita di maschi XXY.

Sono note altre due trisomie, la sindrome di Patau (trisomia 13) e la sindrome di Edwards (trisomia 18). In ambedue i casi, quasi nessuno dei bambini che nasce supera i primi mesi di vita.

GLUCOSIO

GALATTOSIO

Il batterio può trovarsi improvvisamente sommerso dal latte, che contiene lo zucchero lattosio. Il lattosio è un disaccaride contenente una molecola di galattosio legata a una molecola di glucosio. Per essere assorbito e metabolizzato da E. coli, il lattosio deve subire l'azione di tre proteine, una delle quali è la β-galattosidasi, un enzima che catalizza la scissione del legame tra i due monosaccaridi.

Nel 1995 un gruppo di ricercatori capeggiato da Craig Venter e Hamilton Smith sequenziò il primo genoma completo di un microrganismo a vita libera. Essendo un normale "inquilino" dell'intestino umano, E. coli deve essere capace di adattarsi agli improvvisi cambiamenti del suo ambiente; la fonte di energia preferita di E. coli è il glucosio, lo zucchero più facile da metabolizzare.

• Negli operoni reprimibili il repressore entra in funzione solo in presenza di una molecola esterna, chiamata corepressore, che lo rende capace di legarsi all'operatore.

• Negli operoni inducibili il repressore blocca stabilmente l'operatore e viene rimosso solo quando giunge dall'esterno una molecola segnale chiamata induttore che ne causa il distacco;

I tre geni condividono anche uno stesso promotore, ovvero la sequenza di DNA a cui si lega la RNA polimerasi; fra il promotore e i geni strutturali si trova un breve segmento di DNA definito operatore che lega una proteina regolatrice, il repressore. Esiste infine un terminatore, cioè una sequenza che segnala alla RNA polimerasi che la trascrizione è terminata.

3. I trasposoni, l'inserzione di un trasposone nella regione codificante di un gene può avere conseguenze importanti, per esempio produrre una mutazione.

2. Le sequenze moderatamente ripetute

1. Le sequenze altamente ripetute sono brevi sequenze ripetute migliaia di volte;

I genomi degli organismi eucarioti sono pieni di sequenze ripetute:

Gli organismi eucarioti presentano una varietà di forme molto superiore a quella dei procarioti. I regni degli eucarioti infatti sono quattro: protisti, funghi, piante e animali. La sintesi dell'mRNA avviene nel nucleo, mentre la sintesi proteica ha luogo nel citoplasma; prima di uscire dal nucleo, l'mRNA subisce un processo di "maturazione", assente nei procarioti.

mRNA MATURO

Gli studi sul genoma eucariote hanno evidenziato che molti geni che codificano proteine contengono anche sequenze non codificanti, dette introni, intercalate ai tratti codificanti che sono chiamati esoni. I geni formati da esoni e introni sono chiamati geni interrotti. Nel caso dei geni interrotti, la produzione di mRNA comporta, oltre alla trascrizione, un passaggio ulteriore: la rimozione del trascritto primario di mRNA, definito pre-mRNA, dei trascritti degli introni e la successiva saldatura dei trascritti degli esoni. Questo passaggio avviene prima che l'mRNA maturo lasci il nucleo e si trasferisca nel citoplasma. Se le sequenze di RNA corrispondenti agli introni non venissero eliminate, il risultato sarebbe una proteina con una sequenza amminoacidica molto diversa, quasi sicuramente non funzionante.

3. una riparazione per escissione, che rimuove le basi anomale dovute a un agente chimico e le sostituisce con basi funzionali.

2. una riparazione delle anomalie di appaiamento che esamina il DNA subito dopo che si è replicato e corregge gli appaiamenti sbagliati;

1. una correzione di bozze che corregge gli errori a mano a mano che il DNA polimerasi li compie;

Tuttavia, il meccanismo della replicazione del DNA, pur essendo molto preciso, non è perfetto. Innanzitutto il DNA polimerasi compi una quantità notevole di errori. Il DNA delle cellule che non sono in divisione cellulare è danneggiato da alterazioni chimiche naturali delle basi o da agenti ambientali. Per fortuna le cellule dispongono di almeno 3 meccanismi di riparazione:

La rimozione degli introni e la giustapposizione degli esoni avviene attraverso un processo definito splicing dell'RNA, in cui intervengono particolari ribonucleoproteine nucleari chiamate snRNP. La maturazione del trascritto primario comporta anche l'aggiunta di un piccolo "cappuccio" all'estremità 5' e di una lunga "coda" all'estremità 3'. Cappuccio e coda servono per facilitare il legame con i ribosomi e per proteggere l'mRNA dall'attacco degli enzimi idrolitici presenti nel citoplasma che potrebbero degradarlo.

• la sintesi del filamento con l'estremità 3' libera in corrispondenza della forcella procede in modo continuo: questo filamento è detto filamento veloce. La sintesi dell'altro filamento, detto filamento lento, procede in modo discontinuo e a ritroso, operando su segmenti isolati e relativamente piccoli.

Per risolvere il problema vengono prodotti brevi segmenti discontinui, detti frammenti di Okazaki, che poi vengono uniti insieme. La DNA ligasi, che unisce i frammenti produce un filamento lento completo.

• le DNA polimerasi lavorano in una sola direzione, ovvero gli enzimi aggiungono nucleotidi solo all'estremità 3' del primer fino al completamento della replicazione.

• sono capaci di allungare un filamento polinucleotidico, per questo motivo è necessario un filamento di avvio, detto primer. Nella replicazione del DNA il primer è un breve filamento singolo di RNA. Questo filamento di RNA è sintetizzato da un enzima chiamato primasi. Al termine della replicazione, il primer viene eliminato e sostituito da DNA.

Gli enzimi appartenenti alla classe delle DNA polimerasi sono molecole molto più grandi dei desossiribonucleotidi. Le DNA polimerasi possiedono due caratteristiche importanti:

Quando E. coli viene fatto crescere in un terreno contenete glucosio ma privo di lattosio, i livelli di queste tre proteine sono molto bassi: i geni sono inattivi. Se però l'ambiente cambia e il lattosio diventa lo zucchero più abbondante, il batterio si affretta a produrre tutte e tre le proteine. In questo caso i geni che codificano queste proteine vengono attivati, cioè trascritti e tradotti; di conseguenza la concentrazione delle proteine nella cellula aumenta rapidamente. I geni che codificano i tre enzimi coinvolti nel metabolismo del lattosio di E. coli sono un esempio di geni strutturali.

Nella seconda metà dell'Ottocento, grazie ad alcuni importanti esperimenti cominciò a farsi strada nella storia della biologia l'idea che il segreto della vita fosse contenuto nel DNA. All'inizio del Novecento, poi, i genetisti avevano già stabilito una relazione fra i geni e i cromosomi, ma furono necessari altri 50 anni per comprendere il ruolo centrale del DNA.