Enzymologie - Tyrosinase de champignon

Activite 11 : Le phénotype Moléculaire de la pigmentation de la peau

QUESTION : Détailler le mode d'action d'une enzyme : la tyrosinase, une enzyme qui provoque un changement de couleur des tissus. Vous travaillerez sur le champignon de Paris.

2 Expériences sur le champignon de Paris

1 Les mécanismes assurant la pigmentation de la peau

3 Exploitation des résultats

Les mécanismes assurant la pigmentation de la peau

La pigmentation est un processus complexe qui résulte de la synthèse de pigments spécifiques, les mélanines, notamment au sein des mélanocytes (cellules épidermiques) . Cette synthèse s’effectue dans les mélanocytes au sein d’organites appelés mélanosomes, qui migrent dans la cellule, puis sont transférés aux kératinocytes. Les kératinocytes ne font donc que stocker les mélanines et les éliminer lors de leur desquamation. La coloration de la peau résulte donc d’une succession d’étapes : synthèse de mélanine dans les mélanosomes, transport des mélanosomes vers la périphérie des mélanocytes, passage dans les kératinocytes.

Info

La tyrosinase est une protéine appelée enzyme, qui est indispensable pour transformer le produit initial en produit final.

Fabrication de mélanine « in vitro »

Les champignons de Paris contiennent des enzymes dont la tyrosinase nécessaires à la transformation de la tyrosine en mélanine. Un champignon laissé à l'air libre va donc noircir :

Cliquer ici

Protocole de mise en évidence de la présence de tyrosinase dans les tissus responsable de la production de mélanine par les champignons de Paris

Attention, la manipulation doit se faire rapidement pour assurer une bonne extraction de la tyrosinase des tissus du champignon !

1. Numéroter vos tubes de 1 à 3 et indiquez sur chacun d'eux un symbole pour les reconnaitre. Cette symbolique sera également reportées sur les cuves de spectrométrie. 2. Préparation des tubes à essai : remplir 3 tubes selon les proportions suivantes en utilisant les pipettes jaugées : - Tube 1 : 2 mL de solution de tyrosine + 3 mL d’eau distillée - Tube 2 : 2mL d’eau distillée - Tube 3 : 2 mL de solution de tyrosine 3. Préparation de la solution de tyrosinase : - Découper le pied du champignon en petits morceaux (ne prélever que les parties bien blanches) - Broyer le pied du champignon avec le mortier dans 20 mL d’eau froide et un peu de sable. L’extraction ne doit pas durer plus de 30 secondes !! -Filtrer pour obtenir un extrait de champignon 4. Dans les tubes 2 et 3 ajouter 3 mL d’extrait de champignon. 5. Verser une partie du contenu de vos tubes à essai dans les cuves de spectrométrie 1, 2 et 3. 6. Placer le tube 1 à l'obscurité et les tube 2 et 3 à la lumière.

Comment démontrer que la mélanine absorbe les UV pour protéger les organismes de leurs effets néfastes ?

Question 1 : Quel produit s'est formé dans le tube 3 ? Afin de vérifier que la mélanine absorbe bien dans les UV, nous allons réaliser une courbe de l'absorbance des tubes 1, 2 et 3. Pour cela : 1. Allumer le spectrophotomètre ; 2.Régler la gamme d'ondes à 200 nm pour le minimum et à 800 nm pour le maximum ; 3. Faire le blanc : placer une cuve remplie d'eau distillée dans le spectromètre et valider ; 4. Vider le reste du contenu du tube 2 dans une cuve deux aet compléter avec de l'eau distillée ; 5. Placer la seconde cuve dans le spectromètre. Notez vos résultats.

Question 2 : La mélanine absorbe-t-elle bien les UV. Justifier votre réponse.

Exploitation des résultats

Manipulation 1 : La mélanine absorbe-t-elle bien les UV

Exploitation des résultats

Manipulation 2 : La quantité de mélanine joue-t-elle sur la dose d'UV absorbée ?

Cinématique enzymatique

1. Paramètres qui régissent la vitesse d’une réaction enzymatique

Protocole : 1. Préparer votre colorimètre pour les mesures d'absorbance et faire le blanc.

1. Relier le colorimètre au voltmètre.

2. Régler le voltmètre sur 20 V.

3. Placer le filtre comme sur la photo ci-dessous

Cinématique enzymatique

1. Paramètres qui régissent la vitesse d’une réaction enzymatique

Protocole : 1. Préparer votre colorimètre pour les mesures d'absorbance et faire le blanc.

a. Placer la cuve remplie d'eau distillée ;b. Déposer le cache sur votre colorimètrec. Vérifier que le colorimètre est réglé sur %T c. Régler le voltmètre à 1 en tournant la vis macrométrique du colorimètre puis la vis micrométrique pour affiner le résultat. Le blanc est fait. Vous pouvez retirer la cuve.

Cinématique enzymatique

1. Paramètres qui régissent la vitesse d’une réaction enzymatique

Protocole : 2. Préparer votre colorimètre pour les mesures d'absorbance des solutions de tyrosinase issue du champignon.

a. Régler le colorimètre sur Absorbance (Abs) à la place de %T. Une fois le colorimètre paramétré, ne plus toucher à rien.

3. Préparer les solutions contenant la tyrosinase de champignon.

Cinématique enzymatique

1. Paramètres qui régissent la vitesse d’une réaction enzymatique

Protocole : 3. Extraction de la tyrosinase de champignon 4. Préparation du tube à essai : - Pipeter 3 ml d'extrait de champignon - Ajouter 2 ml de la solution de tyrosine mise à votre disposition 5. Verser le contenu du tube à essai dans la cuve pour mesure d'absorbance.6. Effectuer des mesures d'absorbance à t = 0 ; 2 ; 3 ; 6 ; 10 ; 15. 7. Compléter le tableau Excel mis à disposition sur Pearltrees 8. Tracer la courbe représentant l'absorbance en fonction du temps 9. A l'aide d'Excel, calculer le coefficient directeur de la portion de droite disponible 10. Mutualiser vos résultats avec la classe en complétant le fichier Excel ci-contre 11. Construire le graphique de la vitesse initiale de réaction en fonction de la concentration en substrat.

Cinématique enzymatique

2. Conditions optimales de fonctionnement d’une enzyme

Protocole : 1. Préparation du tube à essai : - Pipeter 2 à 3 ml d'extrait de champignon- Ajouter 2 ml de la solution de tyrosine mise à votre disposition2. Chaque groupe réalise une des conditions ci-dessous : - Tube à essai laissé sur la paillasse- Tube à essai mis au bain marie 90 °C- Tube à essai au bain marie 90 °C et à l'ombre - Une cuve mise sous les UV3. Mesurer l'absorbance de votre solution après 30 minutes. 4. Comparer les résultats.

Le synthèse de la mélanine est déclenchée par un processus complexe débutant dans les kératinocytes qui sous l’effet des UV, secrètent l’hormone MSH. La MSH s’attache aux mélanocytes et stimule la synthèse de la tyrosinase (TYR), une enzyme clé de la synthèse de la mélanine. La synthèse de la mélanine a lieu dans les mélanosomes au sein des mélanocytes.

La synthèse de la mélanine est suivie par le transfert des mélanosomes présents dans le mélanocyte aux kératinocytes environnants par l'intermédiaire des dendrites.

La tyrosine est naturellement présente dans les champignons et incolore.

Champignons de 1 jour

Champignons de 6 jours noirs roses

1. Allez chercher votre matériel au congélateur. 2. Découper le pied du champignon en petits morceaux (ne prélever que les parties bien blanches) 3. Broyer le pied du champignon avec le mortier dans 20 mL d’eau froide et un peu de sable. L’extraction ne doit pas durer plus de 30 secondes !! 4. Filtrer pour obtenir un extrait de champignon.