Copia - Clase 23 de mayo AQBM

...continuamos: Microscopia Inmortalización de células

La importancia del uso del microscopio

Monitoreo de la morfología celular: Permite observar la forma y el tamaño de las células, lo cual es crucial para determinar su estado de salud. Cambios en la morfología pueden indicar problemas como contaminación, estrés celular o muerte celular.

Células Hela bajo dos condiciones distintas, la primera control y la segunda alta glucosa.

Evaluación del crecimiento y confluencia Celular: Ayuda a evaluar la densidad celular y determinar cuándo las células han alcanzado la confluencia deseada para la subcultura o para la realización de experimentos. Esto es esencial para mantener las condiciones óptimas de crecimiento y evitar la sobreconfluencia, que puede afectar la viabilidad celular.

Confluencia

Es cuando las células adherentes cubren la superficie del frasco/caja de cultivo. Al cultivar células adherentes, la tasa de crecimiento celular se puede determinar en función de la proporción de células cultivadas que cubren la superficie de adhesión del recipiente de cultivo (proporción del área ocupada por las células o confluencia).

Evaluación de presencia de marcadores celulares a través de técnicas de inmuno tinción.

Phase contrast

Brightlight

Fluorescence

Detección de Contaminación: Es fundamental para identificar contaminaciones bacterianas, fúngicas o por micoplasmas que pueden afectar los cultivos celulares. La presencia de contaminantes puede ser visualizada mediante cambios en la turbidez del medio o la aparición de organismos indeseables en las placas de cultivo.

Contaminación

Contamination of cell cultures is easily the most common problem encountered in cell culture laboratories, sometimes with very serious consequences.

• BACTERIAL
• MYCOPLASMA
• FUNGAL
• YEAST
• EUKARYOTIC
• VIRUS

BACTERIAL

Bacteria can be visualized using phase contrast and 100x - 400x magnification Some bacteria show active movement.

Bacteria often produce toxins that disrupt cell function and ultimately destroy cell cultures. If at all possible, discarding contaminated cultures immediately is recommended. If caught early, it is possible to eradicate bacterial contamination with antibiotics and antimycotic like penicillin-streptomycin (not very reliable in these cases).

MYCOPLASMA

• BACTERIAL
• MYCOPLASMA
• FUNGAL
• YEAST
• EUKARYOTIC
• VIRUS

DAPI staining of Mycoplasma-infected cells

Mycoplasma-positive cell cultures show no visible changes to the media. Mycoplasma are only about 0.1 - 0.3 µm in diameter, therefore detection via brightfield microscopy is not possible. This lack of visible signs of infection increases the risk of mycoplasma-positive cells remaining unnoticed. Misleading and non-reproducible results

What is a mycoplasma?

These are bacteria that lack cell walls. These organisms are resistant to most antibiotics commonly employed in cell cultures. Invades the host by fusing with the cell membrane, making elimination very difficult

MYCOPLASMA

Signs that make suspect we have a mycoplasma infection

• Cell doubling time is increased or decreased rate of cell proliferation
• Maximum confluent cell density is reduced
• Agglutination in suspension cultures
• Morphological deterioration of the cells (size increase).

Mycoplasmas can bind to their host cells using special tip organelles with high concentration of adhesins, to attach to eukaryotic cells and penetrate the host cell. The lack wall in mycoplasma may help it to fuse with the membrane of the host cell and exchange its membrane and cytoplasmic components. Mycoplasmas compete with host cells for biosynthetic precursors and nutrients and can alter DNA, RNA and protein synthesis, diminish amino acid and ATP levels, introduce chromosomal alterations, and modify host-cell plasma membrane antigens. Do not allow for cell division.

Ways of detection: PCR Detection kits, stains DNA, Using DAPI. Electronic microscopy

MYCOPLASMA

How to eliminate mycoplasma? Physical mechanisms (e.g., autoclaving) Chemical mechanisms (e.g., treating with detergent) Immunological mechanisms (e.g., mycoplasma-specific antisera, passage in nude mice, macrophages) Chemotherapeutical mechanisms (e.g., antibiotics) There is no effectual and adaptable method for mycoplasma eradication in all cases!

They all compromise cell integrity

• BACTERIAL
• MYCOPLASMA
• FUNGAL
• YEAST
• EUKARYOTIC
• VIRUS

YEAST CONTAMINATION

Cultures contaminated with yeasts become turbid, especially if the contamination is in an advanced stage. There is very little change in the pH of the culture contaminated by yeasts until the contamination becomes heavy, at which stage the pH usually increases. Under microscopy, yeast appear as individual ovoid or spherical particles, that may bud off smaller particles.

The use of antimycotics can help prevent contamination (streptomycin, fungizone)

FUNGAL CONTAMINATION

Under microscopy, the mycelia usually appear as thin, wisp-like filaments, and sometimes as denser clumps of spores. Spores of many mold species can survive extremely harsh and inhospitable environments in their dormant stage, only to become activated when they encounter suitable growth conditions.

Fungi and mold can appear as small isolated colonies of grey, white or greenish color, floating at the surface of the medium. If the contamination is substantial, the medium will become turbid and cloudy, and spots on the vessel surface may appear. Sometimes fungal contaminations will cause a pH increase of the medium, resulting in phenol-red containing media to appear pink.

Viruses are microscopic infectious agents that take over the host cells machinery to reproduce. Their extremely small size makes them very difficult to detect in culture, and to remove them from reagents used in cell culture laboratories. Using virally infected cell cultures can present a serious health hazard to the laboratory personnel, especially if human or primate cells are cultured in the laboratory. Viral infection of cell cultures can be detected by electron microscopy, immunostaining with a panel of antibodies, ELISA assays, or PCR with appropriate viral primers.

VIRUS CONTAMINATION

The International Cell Line Authentication Committee aims to make false or misidentified cell lines more visible, and promote awareness and authentication testing as effective ways to combat the problem.

cross-CONTAMINATION eukaryotic contamination

While not as common as microbial contamination, extensive cross-contamination of many cell lines with HeLa and other fast growing cell lines is a clearly-established problem with serious consequences. Obtaining cell lines from reputable cell banks, periodically checking the characteristics of the cell lines, and practicing good aseptic technique are practices that will help you avoid cross-contamination. DNA fingerprinting, karyotype analysis, and isotype analysis can confirm the presence or absence of cross-contamination in your cell cultures.

Inmortalización: DEL CULTIVO PRIMARIO A LA LÍNEA CELULAR

La inmortalización celular se refiere al proceso mediante el cual las células adquieren la capacidad de dividirse y proliferar indefinidamente, superando el límite de divisiones establecido por el límite de Hayflick.

La inmortalización puede ser útil en la investigación científica y la producción de líneas celulares para estudios, también es un paso importante en la patogénesis del cáncer.

mecanismos de inmortalización

Activación de telomerasa: Los telómeros son las estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas que se acortan con cada división celular. La enzima telomerasa puede añadir repetitivamente secuencias de ADN en los telómeros, contrarrestando su acortamiento. La activación de la telomerasa es una característica común de muchas células cancerosas y algunas células inmortalizadas en cultivo.

Mecanismos de inmortalización celular

Modificaciones genéticas: Las mutaciones en genes que regulan el ciclo celular y la apoptosis pueden permitir que las células evadan los mecanismos de control y continúen dividiéndose sin restricciones.

Genes supresores de tumores

p53 y Rb

Algunos virus, como el virus del papiloma humano (VPH) y el virus de Epstein-Barr (VEB), pueden introducir sus propios genes en las células huésped que alteran los mecanismos celulares y pueden llevar a la inmortalización.

p53 puede activar la transcripción de genes que bloquean el ciclo celular en la fase G1, impidiendo que la célula entre en la fase de duplicación del ADN hasta que se haya reparado el daño. RB se une a proteínas reguladoras llamadas factores de transcripción E2F, inhibiendo su actividad.

Inmortalización por telomerasas La telomerasa utiliza su ARN molde para sintetizar una secuencia de ADN complementaria a los telómeros. Esto extiende el extremo del cromosoma y evita el acortamiento.

Ventajas: es un método simple, pocos cambios en las características celulares. Desventajas: Baja tasa de éxito.

Ventajas: rapidez Desventajas: cambios en las células.

• Facilitar la manipulación.
• Estudio y la producción continua de células.
• Reproducibilidad.
• Mismo "background" genético.
• Producción de proteínas recombinantes de interés en cantidades más grandes y consistentes.
• Modelos de enfermedades.

End replication problem

Quiz

Leer

Problemas

Del subcultivo de células A545 se obtuvo un conteo de 35 células vivas y 5 muertas en los 4 cuadrantes de la cámara de neubauer. Para realizar este conteo se tomaron 10 ul de la muestra y 90 ul de azul tripano. Responde: 1. ¿Cuál es la viabilidad del cultivo? 2. ¿Cuál es el factor de dilución de la muestra? 3. ¿Cuántas células hay en el cultivo?

Conceptos importantes: Aforo Dilución seriada Pasaje