Presentación Color Pastel

Los efectores de Legionella SidC/SdcA ubiquitinan múltiples pequeñas GTPasas y proteínas SNARE para promover la maduración de los fagosomas.

06/10/18

• Bacilo Gram negativo.
• Tamaño entre 0.3-0.9 x 2-20 micras.
• Intracelular facultativa.
• Aerobia estricta.
• No forma endospora ni cápsula.
• Presenta motilidad.
• Vida libre
• Parasita a amebas de vida libre.

CDC Public Health Image Library (PHIL)

Legionella pneumophila

Introducción

https://www.infobae.com/salud/2022/09/03/que-es-la-legionella-como-se-transmite-y-por-que-puede-causar-enfermedad-mortal/

• confusión
• dolor de cabeza
• diarrea
• dolor abdominal
• fiebre
• escalofríos
• mialgia
• tos
• neumonía grave que puede ser fatal.

• fiebre
• dolor de cabeza
• cansancio
• dolor de garganta
• náuseas)

Fiebre de Pontiac

Forma no neumónica. Tras un periodo de incubación de no más de 48 horas, cursa sin localización pulmonar, que se resuelven en un máximo de 5 días.

Forma neumónica

Son comunes complicaciones renales, hepáticas e insuficiencias multiorgánicas que afectan al tracto gastrointestinal y al sistema nervioso central.

Legionelosis o enfermedad del legionario

Isberg, R., O'Connor, T. & Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nat Rev Microbiol 7, 13–24 (2009). https://doi.org/10.1038/nrmicro1967

Legionella pneumophila modula el tráfico de su vacuola para establecer un nicho replicativo

Dot/Icm Defecto en el tráfico de orgánulos Dot/ sistema de secreción de multiplicación intracelular (Icm).Sistema de secreción tipo IV que injecta más de 330 efectores a la célula huésped.Responsable de la biogénesis y maduración VCL.

La ubiquitina (Ub) se une a la enzima E1 en una reacción dependiente de ATP, luego se transfiere a la enzima E2. La E3 transfiere la ubiquitina al sustrato. Tomado de Hernández 2013.

Ubiquitinación

actividad E3

Dominio de unión a fosfotidilinositiol 4-fosfato (PI4P)

Requerido para la unión a la membrana fagosomal.

Efectores SidC/SdcA (parálogas)

Se ha demostrado que SidC/SdcA es necesario para el crecimiento óptimo de L. pneumophila en macrófagos derivados de la médula ósea.

Ragaz, C., Pietsch, H., Urwyler, S., Tiaden, A., Weber, S.S. and Hilbi, H. (2008), The Legionella pneumophila phosphatidylinositol-4 phosphate-binding type IV substrate SidC recruits endoplasmic reticulum vesicles to a replication-permissive vacuole. Cellular Microbiology, 10: 2416-2433. https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2008.01219.x

Identificar sustratos de ubiquitinación de los efectores SidC/SdcA durante la infección de L. pneumophila en macrófagos.

Objetivo:

8 horas de infecciónMOI 0.05

Fig. S4. Diagrama esquemático de las topologías de estructura secundaria del dominio SNL de SidC. Las hélices alfa están representadas por cilindros y las beta por flechas. flechas. La tríada catalítica prevista está etiquetada y marcada con círculos rojos.

wildtypedotA-ΔsidC/sdcAΔsidC/sdcA (pSidCC46A)ΔsidC/sdcA (pSidC)

Macrófagos derivados de la médula ósearatona A/J 6-8 semanas.

La actividad E3 ligasa de SidC/SdcA es necesaria para el crecimiento óptimo de L. pneumophila.

Fig.1 A) Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDMs) se infectaron con cepas de L. pneumophila de tipo silvestre, dotA-, ΔsidC/sdcA, ΔsidC/sdcA (pSidC), y ΔsidC/sdcA (pSidCC46A) a una MOI de 0.05. B) Infección de L. pneumophila por 2h a una MOI de 0.05, inmunofluorescencia. Las células fueron lisadas con saponina (0.2%) e incubadas 37°C por 30min. A los 4 días de contaron las UFC.

La actividad E3 ligasa de SidC/SdcA es necesaria para el crecimiento óptimo de L. pneumophila.

Células que expresan ubiquitina marcada con 3xHA fueron infectadas con las diferentes cepas de Legionella.

Fig. 2 Candidatos de sustratos de ubiquitinación de SidC/SdcA identificados a partir de células infectadas por L. pneumophila mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

El análisis del ubiquitinoma de células infectadas por L. pneumophila identificó múltiples proteínas GTPasas pequeñas y t-SNARE que son el objetivo de SidC/SdcA.

El análisis del ubiquitinoma de células infectadas por L. pneumophila identificó múltiples proteínas GTPasas pequeñas y t-SNARE que son el objetivo de SidC/SdcA.

Las especies ubiquitinadas se analizaron con un gel SDS-PAGE teñido con CBB seguido de un western blot con anticuerpos específicos.

Se incubaron a 37°C por una hora y se detuvo la reacción utilizando SDS 5X.

40µl de la mezcla de reacción:50mM Tris-HCl (pH 7.5)0.2µg E11µg UbcH75µg ubiquitina2µg de SidC/SdcA2µg de sustrato de proteínas1mM DTT2mM ATP

Ensayo de ubiquitinación in vitro

Fig.3 Se infectaron células HEK293 que expresaban 4xFlag-Rab5/Rab7 y FcγRII con las cepas de L. pneumophila indicadas (MOI = 50). Se prepararon lisados celulares a las 2 h postinfección con RIPA, y se enriquecieron 4xFlag-Rab5 (B) y Rab7 (C) con agarosa anti-Flag y se detectaron por Western blot utilizando anticuerpos anti-Flag.

Validación de los sustratos de ubiquitinación de SidC/SdcA

Figura S4. SidC/SdcA catalizó la modificación de Rab6, Rab8 y Rab11 en la infección por L. pneumophila.

Rab5Rab6Rab7Rab8Rab11son sustratos fisiológicos de SidC/SdcA

Validación de los sustratos de ubiquitinación de SidC/SdcA

Fig. 4 Ubiquitinación inducida por SidC/SdcA de las proteínas t-SNARE STX3 y STX4.

La ubiquitinación de STX3 y STX4 por SidC/SdcA promueve su unión no canónica con Sec22b.

Fig. 5 La ubiquitinación de sintaxina 3 (STX3) y sintaxina 4 (STX4) promueve su acoplamiento no canónico con la proteína v-SNARE Sec22b durante la infección por L. pneumophila.

SidC/SdcA ubiquitina a Rab7 en múltiples residuos de lisina

Fig. 6 SidC/SdcA ubiquitina Rab7 en múltiples residuos de lisina. (A) Se muestran cromatogramas iónicos extraídos de los péptidos trípticos (-KKVLLK-, y -KFSNQYK-) con restos de di-glicina en K6 y K32 de Rab7. También se presentan el péptido de referencia no modificado de Rab7 (-VIILGDSGVGK-) y el péptido de ubiquitina (-TLSDYNIQK-).

SidC/SdcA ubiquitina a Rab7 en múltiples residuos de lisina

FigS6. Ubiquitinación in vitro de Rab7K38R, Rab7K191R y Rab7K194R por SidC. (A) . La ubiquitinación de Rab7 y sus derivados se detectó mediante CBB o Western blotting con un anticuerpo anti-Flag. (B) La cuantificación de la mono-ubiquitinación de Rab7a mostrada en (A) se determinó mediante ImageJ. El panel A es representativo de tres experimentos independientes. Los valores de los paneles B son la media ± DE de tres ensayos independientes.

La actividad E3 ligasa de SidC/SdcA es crítica para la asociación de Rab7 con los fagosomas bacterianos

Fig. 7 Asociación dependiente de SidC/SdcA de Rab7 con el fagosoma bacteriano. Se infectaron BMDMs con cepas de L. pneumophila de tipo silvestre, dotA-, ΔsidC/sdcA, ΔsidC/sdcA (pSidC), y ΔsidC/sdcA (pSidCC46A) durante 2 h a una MOI de 5.

SidC/SdcA contribuye a la evasión de la fusión fagosoma/lisosoma.

Fig. 8 SidC/SdcA previene la acumulación de LAMP1 en LCVs. BMDMs fueron desafiadas con las cepas de L. pneumophila indicadas a una MOI de 5.

Rab cambia entre dos conformaciones, una forma inactiva unida a GDP y una forma activa unida a GTP. Un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) cataliza la conversión de GDP a GTP y provoca la activación de Rab. El Rab activado se une a efectores específicos para promover el tráfico de vesículas. La hidrólisis de GTP inherente a Rab, junto con el efecto potenciador de la proteína activadora de GTPasas (GAP), conduce a la inactivación de Rab. La conversión de Rabs al estado inactivo conduce a la disociación del efector de la proteína Rab.

La ubiquitinación de Rab7 por SidC/SdcA disminuye su interacción con el efector descendente RILP

Fig. 9 SidC/SdcA cataliza a Rab7 activo unido a GTP in vivo.

La ubiquitinación de Rab7 por SidC/SdcA disminuye su interacción con el efector descendente RILP

La ubiquitinación de Rab7 por SidC/SdcA disminuye su interacción con el efector descendente RILP

Fig. 10 La ubiquitinación de Rab7 disminuye su interacción con la proteína lisosomal que interactúa con Rab (RILP).

FigS8. Los efectores de SidC/SdcA ubiquitinan múltiples pequeñas GTPasas Rab y proteínas t-SNARE. La ubiquitinación de sintaxina 3 (STX3) y sintaxina 4 (STX4) aumenta su acoplamiento no canónico con la proteína v-SNARE Sec22b, promoviendo la fusión de vesículas derivadas del RE con las membranas del fagosoma. La ubiquitinación de Rab7 catalizada por SidC/SdcA suprime su unión con la proteína lisosomal que interactúa con Rab (RILP), lo que permite evitar la fusión fagosoma-lisosoma.

La actividad E3 ligasa de SidC/SdcA es crítica para la asociación de Rab7 con los fagosomas bacterianos

¡Gracias!

Fig. suplementaria S4. Diagrama esquemático de las topologías de estructura secundaria del dominio SNL de SidC. Las hélices alfa están representadas por cilindros y las beta por flechas. flechas. La tríada catalítica prevista está etiquetada y marcada con círculos rojos.

wildtypedotA-ΔsidC/sdcAΔsidC/sdcA (pSidCC46A)postlogarítmicaMOI 0.05.

Macrófagos derivados de la médula ósearatona A/J 6-8 semanas.

Escribe un titular genial

Escribe un titular genial

Escribe un titular genial

La actividad E3 ligasa de SidC/SdcA es necesaria para el crecimiento óptimo de L. pneumophila.