Dossier Terapia génica

Dosier

Vectores Virales y No Virales

13 Septiembre 2024

nº

483

Laura Alicia De La Cruz Galvan

Terapia génica 483

U.A Terapia Génica 483

Licenciatura en Biotecnología Génomica

Dendrimeros

Inmunosomas

Polímeros

Liposomas

Índice

Electroporación

Biobalística

Microinyección

Vectores Físicos

Vectores No Virales

Transferencia con Fosfato de calcio

Vectores Químicos

XX

Características principales

Virus adeno-asociado (AAV)

XX

Características principales

Gammaretrovirus

XX

Características principales

Lentivirus

XX

Características principales

Adenovirus

Vectores Virales

13 de Septiembre 2024

Laura Alicia De La Cruz Galvan 2075703

Facilitadora: Dra. Brenda Gonzalez Hernandez

Evidencia 1. Dosier de Vectores Virales y No Virales

Facultad de Ciencias Biologicas

Universidad Autónoma de Nuevo León

Vectores No Virales

Desventajas

Ventajas

- Transfección limitada en células diferenciadas - Es necesario aplicar grandes cantidades de DNA - Requiere optimización previa

Elementos

- ADN - Célula diana - Fosfato de calcio - Cultivo celular - Buffer

Características

El fosfato cálcico forma un precipitado insoluble con el ADN,este complejo Ca-ADN se adhiere a la superficie celular donde es transportado al interior de las células por endocitosis. Debido a su eficacia razonable y a su bajo coste, esta técnica se ha utilizado para introducir ADN en células de mamíferos durante muchos años.

Transferencia con Fosfato de calcio

Capacidad de iones Ca+ para precipitar DNA y acarrearlo al interior

Vectores Químicos

-Incorpora DNA por endocitosis -Eficiencia del 10% -Solo ex vivo

- Bajo costo - Baja toxicidad - Fácil manejo

Title 1

- Material genético - Micro manipulador - Células aisladas

Elementos

Desventajas

Ventajas

- Proceso complejo - Limitado a una sola célula por inyección

- Alta eficiencia de transfección - Alta selectividad de células diana - Dosis controlada de los componentes - No es necesario el uso de vectores inmunogénicos o exotoxicos

- Solo se usa en células in vivo y ex vivo - Permite la transfección de ADN plasmático, ARNm o proteínas directamente al citoplasma o núcleo.

Características

Utiliza fuerza mecánica para perforar la membrana celular y depositar la carga en la célula.

Vectores Físicos

Microinyección

Utiliza energía eléctrica o de gas para acelerar balas compuestas de perlas de tungsteno u oro recubiertas con ADN de vector de expresión hacia las células.

Desventajas

Ventajas

- Las pariculas de oro permanecen en el tejido - Transferencia limitada - Respuestas inmunitarias

Elementos

- Material genético - Partículas o balas - Pistola de genes

Características

Biobalística

- Las balas suelen tener un diámetro de 1-5 μm - Administración in vivo y ex vivo - Permite la transfección de ADN y ARNm

- Fácil manejo

Title 1

La exposición a campos eléctricos pulsados induce cambios estructurales en las membranas de las células biológicas y otros sistemas lipídicos , aumentando la permeabilidad de la membrana para moléculas que de otro modo serían poco permeables.

Desventajas

Ventajas

- El uso de altos voltajes puede causar necrosis, apoptosis o daño permanente en les células

Elementos

- Electrodos- Célula diana- Material genético- Campo eléctrico

Características

Electroporación

- Usado para células primarias, células madre y líneas celulares B - Uso de voltaje eléctrico para aumentar la permeabilidad de la membrana - Transfección de ADN ,ARN, proteínas, fármacos, nanopartículas.

- Alta eficiencia - Versatilidad - Transfección rápida

Title 1

- Lipoplex catiónicos:

Ofrecen mayor eficacia de unión, los más usados son DOTMA y DOTAM. También se conoce la participación de DC-Chol en fibrosis quística

- Lipoplex neutros:

Muestra una carga neutra general a pesar de tener cargas tanto negativas como positivas en diferentes átomos, DOPE es de los más empleados

- Lipoplex aniónico:

ENCAPSULAMIENTO Son mayormente utilizados para transporte de fármacos.

Clasificación

Desventajas

Ventajas

- Cristalización de lípidos- Cinéticas variables- Transfección limitada

Elementos

- ADN - Vesículas - Célula diana - Agente de fusión

Características

Liposomas

Es una vesícula hecha del mismo material que la membrana que transportan material genético en el centro (lipoplex)

Vectores de fusión

- Fabricadas del mismo material que la membrana (fosfolípidos, colesterol y triglicéridos)- Transporte de ADN o fármacos- Captura el 100% de los complejos- In vitro e in vivo

- Liberación controlada - Simple manofactura - Sin limite de tamaño

Title 1

Dendrimero

Polímero ramificado

Polímero lineal

Son macromoléculas formadas por la unión de monómeros. En este caso se utilizan biopolímeros, que son polímeros formados por organismos vivos, son catiónicos y por atracción de cargas se forma el poliplex (complejo DNA/polímero).

Desventajas

Ventajas

- Limitada a células que son cultivadas in vitro.

Elementos

- ADN- Polímero

Características

Polímeros

- Entran por endocitosis- Solubles en medio acuoso y orgánicos- In vitro

- PEG aumenta la biocompatibilidad- Baja toxicidad- Solubilidad en medios acuosos y orgánicos- Baja inmunogenicidad

Title 1

Interacción especifica

- Material genético - Vesículas - Células blanco - Receptores

Elementos

Desventajas

Ventajas

- Cristalización de lípido - Cinética variable- Respuesta inmune adversa

- Liberación controlada- Fácil manofactura- Menor riesgo de efectos secundarios

- Usado para células primarias, células madre y líneas celulares B - Uso de voltaje eléctrico para aumentar la permeabilidad de la membrana - Transfección de ADN ,ARN, proteínas, fármacos, nanopartículas.

Características

Utilizan receptores específicos para la célula blanco.

INMUNOSOMAS

Son moléculas sintéticas como nanopartículas fabricadas a partir de biomoléculas similares a proteínas que ofrecen interacción con sistemas biológicos

Desventajas

Ventajas

- Su funcionalidad depende de la naturaliza del vector, las condiciones del medio en donde será transportado y la localización del núcleo

Elementos

- Dendrímero - Material genético

Características

Dendrímeros

- Pertenecen a SIGMA - Pueden inhibir nucelasas dependiendo del pH - Entrada vía raft- dependiente - Se cree que pueden interactuar con miltiples receptores

- Transfección del 50%- Extremo control de la estructura y tamaño- No necesitan vías de escape- Biocompatibilidad

Title 1

Elementos

• Casete de expresión (gen terapéutico, promotor y sitio de poliadenilación)
• Cenes tempranos: E2 y E4
• Genes tardiós: L1, L2, L3, L4, L5
• ITRs y ψ

Características

• 8 kb de capacidad (E1 y E3 deletados)
• 5kb de capacidad (E1 deletado)
• Fuerte respuesta inmune e inflamatoria FUERTE

Estos vectores eliminan las regiones E1 y E3, lo que permite aumentar la capacidad de carga al eliminar la información genética no esencial.

1era generación

• Replicación deficiente IN VIVO
• Expresión limitada
• Potencial inmunogénico e inflamatorio
• "Tóxicos"

• Diversidad de Serotipos
• No se integran al genoma del huesped

Estructura

Desventajas

Ventajas

Los AdV recombinantes tienen una capacidad de empaquetamiento hasta siete veces superior a la de los rAAV y han tenido un gran éxito en investigación básica y aplicaciones clínicas

Características

Adenovirus

Vectores Virales

Elementos

• - LTR, promotor, PBS, ψ, transgén poliA

Características

• Promotor constitutivo, inducible o de tejido especifico

Con promotor interno

Características

• Más usado (Leucemia murina)
• Solo para células en división
• Capacidad de 8 kb
• Solo 1 ciclo de infección
• Ex vivo
• Se consideran estables (Inserción de ADN al azar)

GAMMA RETROVIRUS

Elementos

• Casete de expresión (gen terapéutico, promotor y sitio de poliadenilación)
• Stuffer DNA
• ITRs y ψ
• Helper virus

Características

- Hasta 36 kb de carga- Eliminación de genes tempranos y tardíos- Necesitan un helper- Stuffer DNA- Respuesta inmune : LEVE

3ra generación

Elementos

• Casete de expresión (gen terapéutico, promotor y sitio de poliadenilación)
• Genes tardiós: L1, L2, L3, L4, L5
• ITRs y ψ

Características

• - Hasta 12 Kb de carga
• - Eliminación de E1,E2A,E2B,E3Y E4
• - Respuesta inmune : MODERADA

Estos vectores eliminan las regiones de E1,E2A,E2B,E3Y E4 lo que permite aumentar la capacidad de carga al eliminar la información genética no esencial.

2da generación

Title 1

Elementos

• Transgen
• Empaquetamiento

• Proteínas VSV-G

Características

Utiliza tres plasmidos distintos:

• Transgen: Contiene la maquinaria de HIV-1 con gen terapéutico
• Empaquetamiento: Contiene todos los genes virales de HIV-1 a excepción de env y hay una mutación en la región de empaquetamiento
• Proteína VSV-G

1era generación

Desventajas

Ventajas

- Posible integración al genoma - Posible activación de oncogenes - Capacidad limitada

- Alta eficiencia de transfección- Fácil manufactura y uso- Expresión semipermanente (meses)

Elementos

• LTR, promotor, PBS, ψ,SD/SA, Señal de empaquetamiento. transgén y poliA

Características

• - Expresión simultanea de 2 genes

Expresión de 2 genes

Características

• Infectan células que no se dividen
• In Vivo y ex vivo
• Se dividen en 3 generaciones.
• Son pseudotipos
• Todos comparten un plásmido VSV-G

Lentivirus

Title 1

Elementos

• Transgen
• Empaquetamiento sin genes accesorios a excepción de gag, pol, tat, y rev

• Proteínas VSV-G

Características

En esta segunda generación de LVs, el plásmido codificador del vector de empaquetamiento contenía sólo gag, pol, tat, y rev

2da generación

Desventajas

Ventajas

-Diversidad transfección entre generaciones - Tóxicidad - Posible inserción al genoma del huésped

- Transducción de células no replicativas

Elementos

• Transgen
• Empaquetamiento solo gag y pol
• Plásmido con rev
• Proteínas VSV-G

Características

• En esta tercera generación fue diseñado para prevenir definitivamente tanto la posibilidad de recombinación con el VIH-1 WT como la movilización del vector dentro del organismo.

3ra generación

Title 1

Literatura

• • Chang, J. (2021). Adenovirus vectors: Excellent tools for vaccine development. Immune Network, 21(1), e6. https://doi.org/10.4110/in.2021.21.e6
• • Chong ZX, Yeap SK, Ho WY. (2021). Transfection types, methods and strategies: a technical review. PeerJ 9:e11165 https://doi.org/10.7717/peerj.11165
• • Godbey, W. T. (2022). Gene delivery. En Biotechnology and its applications (2.a ed., pp. 287-325). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-817726-6.00012-5
• • Mashel, T. V., Tarakanchikova, Y. V., Muslimov, A. R., Zyuzin, M. V., Timin, A. S., Lepik, K. V., & Fehse, B. (2020). Overcoming the delivery problem for therapeutic genome editing: Current status and perspective of non-viral methods. Biomaterials, 120282. doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120282
• • Rems, L. (2017). Applicative use of electroporation models: From the molecular to the tissue level. En Advances in biomembranes and lipid self-assembly (Vol. 26, pp. 1-50). Elsevier. https://doi.org/10.1016/bs.abl.2017.06.001
• • Salauddin, M., Saha, S., Hossain, M. G., Okuda, K., & Shimada, M. (2024). Clinical application of adenovirus (AdV): A comprehensive review. Viruses, 16(7), 1094. https://doi.org/10.3390/v16071094
• • Trivedi, P. D., Byrne, B. J., & Corti, M. (2023). Evolving horizons: Adenovirus vectors’ timeless influence on cancer, gene therapy and vaccines. Viruses, 15(12), 2378. https://doi.org/10.3390/v15122378
• • V D N Gultom (2023) IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci. 1137 012040. DOI 10.1088/1755-1315/1137/1/012040

Desventajas

Ventajas

- Posible integración al genoma - Posible activación de oncogenes - Capacidad limitada

- Alta eficiencia de transfección- Fácil manufactura y uso- Expresión semipermanente (meses)

Elementos

• LTR, promotor, PBS, ψ,SD/SA, Señal de empaquetamiento. transgén y poliA

Características

• Infectan células que no se dividen
• In Vivo y ex vivo
• Se dividen en 3 generaciones.
• Son pseudotipos
• Todos comparten un plásmido VSV-G

Lentivirus

Title 1

Estos vectores no pueden replicarse por sí mismos y dependen de células de empaquetamiento, como las células HEK293 que expresan la proteína E1, para su producción.El vector es capaz de transportar hasta 8,2 kb de carga de ADN externo con mayor inmunogenicidad.

Características

• 8 kb de capacidad (E1 y E3 deletados)
• 5kb de capacidad (E1 deletado)
• Fuerte respuesta inmune e inflamatoria

• Casete de expresión (gen terapéutico, promotor y sitio de poliadenilación)
• Cenes tempranos: E2 y E4
• Genes tardiós: L1, L2, L3, L4, L5
• ITRs y ψ

El adenovirus es un virus sin envoltura con una cápside proteica icosaédrica y un genoma de ADN lineal de doble cadena.

Estructura

• Diámetro de 90 nm
• Genoma de 36 kb
• Cuenta con 11 proteínas estructurales, ademas cada una de las 20 facetas de la cápside icosaédrica está compuesta por 12 trímeros de hexones y un pentón en cada vértice.

• Infectan tanto células en división como células que no se dividen
• Serotipos más usados: Ad2 y Ad5
• Se dividen en 3 generaciones.
• Capacidad de inserción máximo 37 kb

Chang J. Adenovirus Vectors: Excellent Tools for Vaccine Development. Immune Netw. 2021 Feb;21(1):e6. https://doi.org/10.4110/in.2021.21.e6

Caracteristicas principales

Los vectores de adenovirus son herramientas versátiles en la terapia génica, el tratamiento del cáncer y el desarrollo de vacunas debido a su alta eficiencia de transducción, gran capacidad transgénica y capacidad para inducir inmunidad innata