Dossier-Terapia Génica

Terapia GénicaFacilitador: Brenda González HernándezEvidencia 1. Dossier de VectoresGrupo: 483Silvia Rubí Guerrero Flores 1819496Rodrigo Manuel Gómez Sauceda 191999206/09/2024

Universidad Autónoma de Nuevo LeónFacultad de Ciencias BiológicasLic. Biotecnología Genómica

• Vectores No Virales:- Métodos Químicos- Métodos Físicos- Métodos de Fusión- Métodos de Endocitosis• Vectores Virales:- Gammaretrovirus- Lentivirus- Adenovirus- Adenoasociados

Acarradeores que facilitan la transferencia de un gen exógeno a la célula diana.

Tipos de Vectores

Vectores

Fueron los primeros en utilizarse y los más bioseguros en comparación con los vectores virales.Forman un complejo-DNA capaz de unirse a la membrana celular por endocitosis y finalmente alcanzar el núcleo para tener una expresión estable y eficiente del transgen.

Vectores No virales

Ca3(PO4)2

Ca3(PO4)2

Ca3(PO4)2

El ADN se suspende en una solución de cloruro de calcio y luego se combina con un tampón de fosfato, lo que induce una precipitación por cargas. Se transporta a cultivos celulares donde ingresara el precipitado por pinocitosis.

Producción

Ventajas:- Económico- No es tóxicoDesventajas:- Activa ROS- Eficacia del 10%- Unicamente Ex vivo

Es de las primeras técnicas desarrolladas encargadas de acarrear del exterior al interior de la célula material genético. Se basa en su capacidad para precipitar el DNA y luego internalizarlo a través de pinocitosis.• Requiere: Buffer de fosfato, dextran y DNA en cloruro de calcio• Expresión transitoria

Transferencia con fosfato de calcio

Método químico

Producción

Ventajas:- Alta eficacia de transfección de 30%- Eficaz en pielDesventajas:- Se necesitan céluas aisladas- Ex vivo- Unica excepción en embriones (in vivo)

Microinyección

Método Físico

Se inserta el DNA de interés en el núcleo con ayuda de una aguja microscópica. • Requiere: Células aisladas, microscopio, micromanipulador, aguja y DNA de interés• Sistema de micromanipulación• Se utiliza principalmente en organismos transgénicos o al introducir RNA antisentido

Producción

Consiste en colocar el DNA de interés en la superficie de una "bala" de tuxteno de entre 1μm-20μm capaz de formar un poro. • Requiere: Stock grande de células, microproyectiles, descarga eléctrica o de gas y DNA de interés• Existen protocolos de vacunación con esta técnica• Expresión transitoria

Ventajas:- Penetra hasta 20 capas de células- In vivo (pistola de genes) e in vitro- Fácil manejoDesventajas:- Todavía no es usado en humanos- Eficacia variable- Integración de solo el 10-8- Integraciones múltiples- Produce muerte celular

Biobalística

Método Físico

Aumenta permeabilidad

≈ 200 v/cm

Producción

Se basa en la aplicación de pulsos eléctricos ≈ 200 v/cm con el propósito de alterar la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del DNA de interés a través de los poros.• Requiere: Buffer que permita la conducción de electricidad, electrodos de vidrio, evaluar intensidad de campo eléctrico y la impedencia del tejido, electroporador y DNA de interés.

Ventajas:- In vivo (en modelo animal) e in vitro- Utilizado principalmente para piel, músculo e hígado (estandarizado)- Aumento de eficacia con HialuronidasaDesventajas:- Se utilizan grandes cantidades de DNA- Muerte celular significativa- Eficacia baja de 20-30%, depende de varios factores- Transitorio

Electroporación

Método Físico

Aumenta permeabilidad

• Requiere un aumento de presión hidrostática para la generación de poros o microdefectos en membrana.• In vivo

• Requiere viales de buffer patentadas y un nucleofector específico para cada tipo celular.• Eficacia alta de 90-99%

Inyección intravascular hidrodinámica

Nucleofección

Variaciones de Electroporación

Método Físico

Aumenta permeabilidad

Producción

Se basa en la generación de burbujas de aire a partir de ondas ultrasonicas de baja intensidad (MHz) las cuales chocan con la membrana incrementando la permeabilidad celular.• Requiere: Equipo de sonoporación y DNA de interés.• Expresión transitoria

Ventajas:- In vitro/ex vivo- Estandarizado en células de paredes vasculares, corazón y músculoDesventajas:- Eficacia variable

Sonoporación

Método Físico

Producción

Se compone de la utilización de nanopartículas catiónicas recubiertas del DNA de interés guíadas por un campo magnético.• Requiere: Campo magnético, nanopartículas catiónicas magnetizadas y DNA de interés

Ventajas:- Rápido (en minutos)- Eficiente- Universal- In vivo e in vitroDesventajas:- Dependiendo el material de nanopartículas puede ser tóxico

Magnetofección

Método Físico

Producción

Se enfoca en la introducción del DNA desnudo de manera directa sin ningun tipo de portador. Se inyecta vía intramuscular e ingresa de manera pasiva o activa en las células.• Requiere: Aguja y DNA de interés.• Es reconocido el DNA por el poro nuclear, sin embargo, aún no se sabe cómo es esto posible.

Ventajas:- Rápido - Enfocado en tejidos como timo, piel, músculo cardíaco y esqueléticoDesventajas:- Bajo porcentaje de transfección- Sólo in vivo

DNA Desnudo

Método Físico

Purificación

Sonicación

Medio acuoso con DNA y lípidos

Producción

Consiste en la formación de vesículas compuestos de fosfolípidos, colesterol o trigliceridos capaces de encapsular o generar complejos los cuales se fusionan con la membrana celular y facilita la entrada del DNA de interés.• Requiere: Fosfolpipidos, equipo de sonicación, medio acuoso y DNA de interés• Expresión transitoria• La unión del liposoma más el DNA es llamado Lipoplex

Ventajas:- Liberación controlada- Simple manufactura- Protege de nucleasas- No hay límite de tamaño- Se pueden volver específicosDesventajas:- Cristalización de lípidos- Cinéticas variables- Eficacia baja

Liposomas

Método de Fusión

Lípidos Neutros:Utiliza lípidos Zwitterianos y dependiendo la conducción se vuelve positiva o negativa.

Lípidos Catiónicos:Forman lipoplex de complejo de DNA-Liposoma, tienen atracción orgánica con la membrana creando una condensación entre cargas negativas y positivas.• Se captura el 100% de los complejos• 20-110 nm

Lípidos Aniónicos:Forman lipoplex de encapsulamiento de DNA, pero debido a su carga negativa requiere ligandos para entrar a la célula.• Sitio-específicos

Tipos de lípidos

Método de Fusión

Virosoma

• Se utiliza una secuencia membranal de virus sendai en lípidos aniónicos.• Permiten la fusión con la membrana de las células diana.• Modifica el pH y permite la acción de una bomba de protones el cual participa de manera complementaria para la fusión del virosoma con la célula.

Lipofectamina

• Se utiliza la combinación de un polication y un lípido neutro en una formulación 3:1 (W/W) correspondientes a DOSPA y DOPE.• Aumenta la eficacia en cultivos hasta un 80%

Variantes

Método de Fusión

Unir covalentemente ligandos

Purificación

Sonicación

Medio acuoso con DNA y lípidos

Producción

Son liposomas en las que se agregan ligandos reconocidos por anticuerpos volviendolos sitio-específicos.• Requiere: Liposomas, ligandos específicos y DNA de interés.• Utilizado para la transportación de fármacos

Ventajas:- Dirigen el liposoma al tejido de interés- Inducen endocitosisDesventajas:- Barreras biológicas pueden limitar la distribución

Inmunoliposomas

Método de Endocitosis

Estos reactivos se sintetizan de forma especial en empresas como ThermoFisher, Sigma-Aldrich, PolySciTech y Gelest.

Producción

Son compuestos de subunidades repetitivas de monómeros producidos por organismos in vivo, cumplen la misma funsión que los liposomas sin embargo no utiliza lípidos.• Requiere: Polímeros, DOPE y DNA de interés• Sólo utiliza polímeros catiónicos• La unión del biopolímero y el DNA es llamado Poliplex

Ventajas:- Biocompatibilidad con PEG- Baja toxicidad- Poca inmunogenicidad- No forma aglomerados- Más eficiente que LípidosDesventajas:- No puede liberar el DNA en citoplasma, requiere un agente fusogenico

Método de Fusión

Biopolímeros

Estos reactivos se sintetizan de forma especial en empresas como ThermoFisher, Sigma-Aldrich, Dendritech, Inc. y PolySciTech

Producción

Ventajas:- Inhiben nucleasas- Eficacia hasta del 50%- Toxicidad baja- in vitro e in vivo- Recognición multivalente- Robusta contrucción constanteDesventajas:- A mayor generación mayor eficacia pero más tóxico

Son de origen sintético compuestos de nanoparticulas de biomateriales, suelen tener una forma de dendron (árbol) capaces de interactuar con sistemas biológicos.• Requiere: Dendrímero y DNA de interés• Compuesto por varios números de ramas las cuales son conocidad como generaciones• El dendron tiene carga neta positiva

Dendrímeros

Método de Endocitosis

Poli-L-Lisina (PLL):Es tres veces más eficiente que un lípido catiónico.• La unión de lípidos más PLL aumenta diez veces más su efectividad y es llamado Poliplex Conjugado• Al agregar un receptor o promotor se vuelve específico• Usado en sistemas hépatico, nervioso y pulmonar

Poli-etileno-glicol (PEG):Polímero lineal asociado a un liposoma por lo cual es llamado Polímero Conjugado.• Considerado "estabilizador esterico" por lo que se mantiene más tiempo en circulación• Si se entrecruza de lípidos es llamado Lipopoliplex

Método de Fusión

Tipos de biopolímeros

Estos reactivos se sintetizan de forma especial en empresas como GenScript, Altogen Biosystems, Sino Biological y Creative Biolabs.

ReceptoresASORTNFMoAbGalactosaNT

Producción

Ventajas:- Especificidad- Inducen endocitosisDesventajas:- Producción complicada- Barreras biológicas pueden limitar la distribución

Son policationes conjugados con un ligando volviendolos sitio-epecíficos. • Requiere: Polímeros catiónicos, receptores específicos y DNA de interés

Mediados por Receptor

Método de Endocitosis

La mayoría tiene la capacidad de modificar el genoma lo que los vuelve menos seguros, sin embargo, tienen una mayor eficiencia y alcanzan un mayor rango de transfección.

Vectores virales

Vector Silvestre

En la década de 1990 se basaron los vectores virales principalmente en gammaretrovirus debido a:• Su simplicidad genética • Eficiencia para infectar una amplia variedad de tipos de células diferentes• Capacidad para integrar su información genética en el genoma de las células infectadas

Gammaretrovirus

8 Kb

Los vectores virales basados en gammaretrovirus se producen en células de mamíferos cultivadas. Primero se obtiene un plásmido que contiene el ADN proviral, mediante procedimientos de clonación estándar, se amplifica en bacterias y se purifica. Luego, este plásmido se transfecta en una línea celular de empaquetamiento, es decir, una línea celular, generalmente de origen murino, que expresa los genes retrovirales gag, pol y env , que ya no están presentes en el plásmido del vector retroviral pero que, sin embargo, son necesarios para la producción de viriones.

Producción

Ventajas:- Eficacia en transfección - Integracion en la celula huesped Desventajas:- Bajas concentraciones - Mutagenesis - Silenciamento de exprecion genica - Sólo infecta células en división

Construcción de Vector

Vector Silvestre

A finales de 1990's la posibilidad de obtener vectores basados en el VIH-1 y otros lentivirus ha resultado muy atractiva para aplicaciones de transferencia génica in vivo y ex vivo. •La mayoría de los vectores disponibles en la actualidad se han derivado del lentivirus VIH-1, principalmente por la abundante información existente sobre las características de este virus• Tienen la capacidad para infectar cualquier célula post-mitotica• Es considerado pseudotipo

Lentivirus

8 Kb

• El vector del transgen se queda igual.
• El segundo vector se eliminan vif, vpr, vpu y PPT.

• En el vector del transgen se elimina Pol y los genes accesorios
• En el segundo vector se eliminan los LTR, se agrega un promotor fuerte, se elimina PBS y se elimina Ψ

Construcción de Vector

8 Kb

La producción de los vectores se lleva a cabo mediante la transfección transitoria de células de riñón embrionario humano 293 T (HEK 293T, que expresan la proteína del antigeno T de SV40) con estos tres plásmidos; los viriones que contienen el ARN del vector retroviral se encuentran luego en la célula sobrenadante de cultivo

• En el vector del transgen se elimina U3 y se agrega un promotor (RSV).
• En el segundo se elimina PPT y Ψ.
• En el tercer vector se usa REV para su expresión.
• En el cuarto se usa VSV-G

Ventajas:- Trasfección en celulas en división in vivo e in vitro.- Integración al genoma de la celula huesped. Desventajas:- Necesita un pseduotipo.- Posible mobilizacion del vector en pacientes con VIH.

Producción

Vector Silvestre

.El adenovirus fue aislado por primera vez en 1953 a partir de tejido adenoideo (de ahí su nombre), obtenido durante una amigdalectomía en un niño. En la actualidad, se conocen más de 100 miembros de la familia Adenoviridae, los cuales pueden infectar tanto a humanos como a varias especies animales, incluyendo no humanas.Debido a la capacidad de este virus para infectar células epiteliales, se consideró su uso en el tratamiento de la fibrosis quística. El tropismo natural de los adenovirus por el epitelio respiratorio y la conjuntiva está relacionado principalmente con su forma de transmisión, más que con características moleculares específicas.El receptor que facilita la infección por adenovirus se expresa de manera ubicua en diferentes tipos de células, lo que permite que la mayoría de ellas mantengan la replicación del virus, independientemente de si están en fase de replicación activa o no. Esto abre la posibilidad de utilizar adenovirus como vectores para la transferencia de genes a prácticamente cualquier órgano.

Adenovirus

Los vectores adenovirales de primera generación se obtienen sustituyendo las regiones E1, o E1 y E3, por un casete de expresión.

E3

5-8 Kb

Construcción de Vector

Los vectores adenovirales de tercera generación se caracterizan por la eliminación completa del genoma adenoviral y su sustitución por ADN exógeno, con excepción de las regiones requeridas en cis para la replicación y empaquetamiento del ADN viral (ITRs y ψ respectivamente).

Esta generación presentan deleciones adicionales en la región E2, en particular, en los genes E2A (que codifica DBP), E2B (TP) o de la ADN polimerasa, o en la totalidad o la gran mayoría de la región E4. Estos vectores pueden alojar hasta 14 kb de ADN extraño.

37 Kb

14 Kb

14 Kb

14 Kb

• Se basa en el uso de células HEK 293 previamente seleccionadas para expresar la recombinasa Cre (293Cre). • Estas células se transfectan con el vector gutless linearizado y se infectan con un vector adenoviral de primera generación en el cual la región ψ está flanqueada por dos secuencias loxP.

A) Método basado en recombinación en células helper• Aprovecha los eventos de recombinación que ocurren espontáneamente en células de mamíferos entre dos secuencias de ADN homólogas.• Células HEK293 + un plásmido sin E1 + plásmido con transgenB) Método basado en recombinación y amplificación en bacterias• Se basan esencialmente en la utilización de un plásmido grande que contiene el genoma adenoviral completo y un plásmido que contiene un casete de expresión para el gen de interés, flanqueado por regiones de homología

Producción 1ra y 2da generación

Producción 3ra generación

Ventajas:- Alta tranfección.-Alto nivel de expresión del transgen.- En produccion son altas las concentraciones.- Tranfección en celulas en divisón y no división.- Amplio rango de tejidos.Desventajas:- Tranfección transitoria.- Respuesta Inmune e inflamatoria alta

Organización genómica del AAV, con la indicación de los promotores (p5,p19, p40), los codones AUG para la traducción de las proteínas codificadas por Cap y el sitio de poliadenilación.

Vector Silvestre

La familia Parvoviridae (parvo-: en latín, “pequeño”) incluye una amplia serie de virus pequeños, con simetría icosaédrica, sin envoltura, conteniendo un genoma de ADN monocatenario, que infectan a numerosas especies de mamíferos, incluido el hombre.Género Dependovirus, cuyos miembros, a diferencia de los eritrovirus, son incapaces de una replicacion autonoma y dependen de la superinfección de las células con otro virus para completar su ciclo replicativo, de ahí el nombre (AAV).

Adenoasociados

Producción de vectores AAV. Para la producción de vectores AAV, se transfectan transitoriamente dos plásmidos en células HEK 293. El primer plásmido corresponde al propio vector AAV, en el que el casete del gen terapéutico está flanqueado por las repeticiones terminales invertidas (ITR), y el segundo codifica para Rep y Cap y para las proteínas adenovirales que proporcionan funciones auxiliares. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lisan y los vectores se purifican mediante centrifugación con cloruro de cesio.

5 Kb

Construcción de Vector

Producción

Ventajas:- Este es derivado de un virus no patógeno.- Producción en altas concentraciones.-Infección en células en no división - Expresión persistente y a largo plazo. Desventajas:- Limitacion de en el tamaño 5kb- Perdida del vector en la manipulación con la celula empacadora. - Tropismo limitado