Ev1_483_TerapiaGénica

Licenciatura en Biotecnología Genómica

Facultad de Ciencias Biológicas

Universidad Autonoma de Nuevo León

Terapia génica

Evidencia 1

Dosier de vectores

Facilitador: Dra. Brenda Gonzalez HernandezEquipo:Ponce Refugio Axel Gael - 1966002Garnica Jiménez Edson jair - 1919444Fecha : 13 / 09 / 2024

En el ámbito biotecnológico y médico, los vectores son moléculas de ADN que contienen un inserto de ADN extraño que se utilizan para transportar el gen de interés al genoma de la células objetivo. Los vectores funcionan como vehículo para transportar una molécula o compuesto de interés. Por tal motivo son importantes en la investigación y tratamientos clíncios, ya que, permiten modificar células o tejidos específicos y transferir genes o medicamentos.Entre los vectores más comúnmente usados estan plásmidos, lípidos, nanopartículas y virus. Llegan a clasificarse en dos grandes grupos dependiendo de la técnica y el origen del vector: Vectores virales y no virales. En este trabajo se pretende describir a detalle cada uno de los tipos de vectores utilizados en la actualidad que son de importancia médica y biotecnológica.

Vectores de Transferencia

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 14 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 14 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 15 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 16----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------17

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 10 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 11 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 12----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------13

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 6 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 8----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------9

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 2 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 4----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5

Microinyección CaracterísticasEstructura, Componentes y MétodoVentajas y DesventajasAplicacionesBiobalísticaCaracterísitcas Estructura, Componentes y MétodoVentajas y DesventajasAplicacionesElectroporaciónCaracterísticasEstructura, Componentes y MétodoVentajas y DesventajasAplicacionesNucleofecciónCaracterísticasEstructura, Componentes y MétodoVentajas y DesventajasAplicaciones

ÍNDICE

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 30 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 30 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 31 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 31

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 24 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 25 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 27----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------28--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 18 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 19 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 21----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------22--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 23

ÍNDICE

LiposomasCaracte´risticasEstructura y ElementosMétodo de producciónVentajas y DesventajasAplicacionesBiopolímerosCaracterísticasEstructura y ElementosMétodo de producciónVentajas y DesventajasAplicacionesDendrímerosCaracterísticasVentajas Aplicaciones

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 49

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 46 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 46 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 47--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 39 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 39 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 40

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 36 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 37

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 33

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 34 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 35

ÍNDICE

Estrucutura de vectores viralesGammaretrovirusVentajas y DesventajasEstructura de vectoresLentivirusVentajas y DesventajasEstructura de vectoresAdenovirusVentajas y DesventajasEstructura de vectoresAdenovirus AdenoasociadosVentajas y DesventajasGenoma del AdenovirusProducción del Vectro AVV Literatura

Vectores No-Virales

Terapia Génica

Método para inyectar mecánicamente células, material genético, péptidos, fármacos u otros agentes exógenos directamente en células o tejidos utilizando una pipeta muy pequeña.Consiste en la inserción del DNA mediante una inyección en el núcleo mediante un micromanipulador.

Microinyección

características

Propiedades Microinyeccion

• • Alta eficacia de Transfección
• • Es una de las técnicas más usadas en invertebrados
• • Se usa ex vivo
• • Y en embriones in vivo
• • La eficacia de integración genica es del 30%

1. Se prepara la micropipeta o aguja de vidrio calentandola hasta formar una punta fina de 0,5 mm de diámetro. 2. Las células a microinyectar se colocan en un recipiente. 3. Se coloca una pipeta de retención cerca de la célula objetivo. 4. La micropipeta de la muestra se monta en un micromanipulador.5. La micropipeta se introduce en la membrana celular y se inyecta en la célula aplicando presión hidrostática con un microinyector. 6. Al final, la aguja de la micropipeta vacía se retira de la célula con lentitud y cuidado.

Método

Al inyectar transgenes, se usa una pipeta de sujeción para sujetar el ovocito e insertarle el esperma mediante la aguja de inyección.

La microinyección hace uso de un microscopio que esta equipado con un inyector a presión (a), micromanipulador (c) y placa de microinyección (f) donde irá la muestra.

Microinyección

Estructura y Componentes

ventajas

• No usa marcadores de selección
• Administración precisa de materiales en términos de volumen y tiempo
• Fácil identificación mediante coinyección de colorante
• Requiere menos preparación de proteínas en comparación con electroporación

desventajas

• Experiencia técnica necesaria para dominar la microinyección
• Requiere mucho trabajo y tiempo
• Escalabilidad limitada
• No se complementa con pasos de Purificación y Western Blot

Microinyección

Aplicaciones de la microinyección y uso en terapia génica La microinyección tiene numerosas aplicaciones clínicas y de investigación, incluida la transfección de células mediante inyección de ADN, la fertilización mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), la introducción de células madre embrionarias modificadas genéticamente en un blastocisto, y más. Utilización de la microporyeción • Organismos transgenicos • Para introducir Rna antisentido • Eficaz para introducir DNA en la piel

Microinyección

Aplicaciones

Propiedades de la biobalísitca

• De eficacia variable y expresión transitoria
• Integración solo de 10-8
• Se usa tanto I vitro como in vivo
• Es de fácil manejo
• Integraciones múltiples
• Produce muerte celular

Método para introducir ADN en las células por medio de partículas microscópicas (micropartículas) aceleradas a velocidades supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular.permite manipular cualquier tipo de célula haciendo uso de microproyectiles de 1um a 20um de tamaño.

Biobalística

características

• El equipo de biobalística funciona con gas helio a alta presión que se concentra en una cámara de presurización.
• La onda de choque se libera perforando unas membranas denominadas membranas de ruptura.
• El gas liberado impulsa las micropartículas recubiertas con el ADN, las cuales impactan en el tejido vegetal a transformar o explanto.
• La cámara con el material vegetal se encuentra en condiciones de vacío parcial para reducir la fuerza de rozamiento del aire.
• Las partículas recubiertas por el ADN o gen de interés, se acompañan de otras secuencias (promotor y terminador) y genes, facilitando la inserción en el genoma de la célula receptora

Método

Para este método se emplea un cañon génico, el más usado el PDS/1000He (izquierda), el cual cuenta con una cámara principal donde se bombardea la muestra mediante la liberación de helio comprimido que dispara los micropoyectiles a gran velocidad (centro). La alternativa al cañon es la pistola de genes de mano que trabaja sin vacío y puede manipular hasta organismos vivos (derecha)

Biobalística

Estructura y componentes

ventajas

• Transforma células de manera directa y al azar
• Inserta genes en el núcleo celular
• Requiere menos preparación de proteínas en comparación con electroporación
• Permite la transformación específica de cualquier tejido y tipo de célula

desventajas

• Sistema costoso
• Requiere equipo especializado
• Es necesario conocimiento técnico especializado en el método

Biobalística

Se usa principalmente para la producción de organismos transgénicos y muy usado en modificación de células vegetales. También se ha usado como coadyuvante para tratamientos de cáncer. Uso de la biobalística • Protocolos de vacunación • Transformación de células vegetales • Creación de plantas transgenicas : monlcotiledoneas (maíz y arroz) y dicotiledoneas (soya, tabaco y algodón)

Biobalística

Aplicaciones

10

La Eficacia de la electroporación va depender de: • Intensidad del campo eléctrico • La impedancia específica del tejido • Longitud y número de pulsos • Forma, tamaño, arquitectura y tipo de electrodos • El buffer utilizado • Tamaño de la célula

Fenómeno físico que determina la permeabilización de las membranas celulares a través de la aplicación de impulsos eléctricos. Puede ser reversible cuando la permeabilización es temporal o irreversible cuando comporta la muerte celular después de un daño irreparable de la membrana celular.También es llamada electropermeabilización o electrotransferencia.

Electroporación

características

11

Método

• Se agrega un plásmido a un cultivo de células competentes las cuales se incuban en hielo por 20 min.
• Luego se realiza una electroporación a 175V/cm durante intervalos de 5ms
• Se adiciona medio LB y se centrifuga
• Se elimina el medio y se siembra y cultiva el sobrenadante a 37°C toda la noche
• Se obtienen clonas recombinantes

En un electroporador se ingresa una cubeta la cual contendrá la muestra. Esta cubeta estará rodeada deunos electrodos los cuales enviarán los pulsos eléctricos que permitirán que la membrana de la muestra sea ma´s permeable. Los pulsos tienen una carga de 200V/cm y se realizan en intervalos de aproximadamente 5ms.

Electroporación

Estructura y componentes

12

ventajas

• Técnica simple
• Es reporducible
• Gran eficacia

desventajas

• Require desenganchar células del sustrato
• Mortalidad celular alta
• Se tiene que ajustar condiciones para cada tipo celular

Electroporación

13

En la medicina, la electroporación se usa para:• Manipulación genética y modificación del ADN celular • Tratamiento de tumores • Terapias génicas • Administración de medicamentos a través de la piel • Ensayos de permeabilidad celular • Estudios de liberación controlada de medicamentos

Electroporación

Aplicaciones

14

Tecnología de electroporación mejorada introducida por Amaxa en 2001 que utiliza una combinación de parámetros eléctricos y soluciones específicas para cada tipo celular que permite la transferencia de una molécula directamente al núcleo de las células. Gracias a que es un método independiente de la propia proliferación celular, la nucleofección permite transfectar de forma eficiente incluso células primarias que no se dividen (como las células T o neuro)

Nucleofección

características

15

La nucleofección utiliza una combinación de parámetros eléctricos, generados por un dispositivo llamado Nucleofector, con reactivos específicos de tipo celular. El sustrato se transfiere directamente al núcleo celular y al citoplasma. Por el contrario, otros métodos de transfección no viral de uso común se basan en la división celular para la transferencia de ADN al núcleo. Por tanto, la nucleofección proporciona la capacidad de transfectar incluso las células que no se dividen, como las neuronas y las células sanguíneas en reposo.

Método

Para llevar a cabo la nucleofección se utilizan equipos especiales como el 4D nucleofector o el shuttle de 96 pocillos de la compañia Lonza. Estos equipos vienen con kits especiales y protocolos optimizados para cada tipo celular que la misma compañia brinda.

Nucleofección

EQuipo y Elementos

16

ventajas

• Alta eficiencia de transfección
• Excelente preservación
• Fácil de usar
• Análisis a las pocas horas
• Mínimo riesgo de contaminación
• Escalado flexible

desventajas

• Requiere reactivos de Lonza
• Equipos costosos
• Mortalidad celular en condiciones óptimas
• Se desconoce formulación de tampones
• Parámetros de los programas no son manipulables por el usuario

Nucleofección

17

Se utiliza para transfectar células primarias, neuronas, líneas celular y células madre. Puede utilizarse en edición de CRISPR, terapia génica, generación de iPSC e inmunoterapia. También en aplicaciones ex vivo de terapia génica

Nucleofección

Aplicaciones

18

Son pequeñas partículas parecidas a la grasa que se producen en laboratorio. Están compuestos por fosfolípidos, la misma molécula que predomina en las membranas de las células. Son vesículas artificiales que se usan en la medicina y la cosmética para transportar sustancias como medicamentos, genes y etiquetas de imagenología médica.

Liposomas

Características

19

Lípido-Nanopartícula

3era Gen con Ligando

2da Gen Pegilado

1era Gen Convencional

De acuerdo a su evolución también se clasifican en 1era, 2da y 3era generación. La última se llama Liposfera.

Un liposoma al cual se le adiciona un ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, para transportar a un tejido diana, se le conoce como lipoplex. El cual se clasifica en: de membrana, micela y encapsulamiento y se caracteriza por poder liberar el contenido en el citoplasma.

La partícula liposomal básica se compone de una cabeza hidrófila, la membrana de fosfolípidos y una colo lipófila. En su interior se coloca el gen o componente de interés que transportará.

Liposomas

Estructura y componentes

20

También de acuerdo a la estructura membranal o si están cargados con algún agente como PEG, se consideran Catiónicos, Neutrales o Aniónicos.

De acuerdo al componente que acarrean podemos encontrar otra clasificacio´n, donde encontramos los cubosomas, los liposomas cargados de fármaco, los sólidos y los silenciosos.

Liposomas

Estructura y componentes

21

De acuerdo con el ejemplo de Bayas y Brito 2009: Los liposomas se prepararon utilizando Fosfatidilcolina de soya (Soy Phosphatidilcholine o PC) y colesterol1. Preparación de soluciones base de PC y colesterol. 2. Preparación de mezclas de PC y Colesterol. 3. Evaporación del solvente de las mezclas PC- Colesterol. 4. Hidratación del lípido seco. 5. Uso de ultrasonido para inducir la formación de liposomas en la solución acuosa. 6. Extrusión de la solución de liposomas. Para obtener liposomas de tamaño nanométrico, la solución primaria se sometió a extrusión a través de una membrana de policarbonato con tamaño de poro de 100 nm

Liposomas

Método de producción

22

ventajas

• Incremento en la eficacia e índice terapeútico en el área médica
• Aumentan estabilidad po encapsulación
• Son atóxicos
• Reducen la toxicidad de agentes encapsulados
• Son flexibles y sitio específicos

desventajas

• Baja solubilidad
• Tiempo de vida relativamente corto
• Químicamente inestable
• Costo elevado

Liposomas

23

Se utilizan para el transporte de fármacos, de ácidos nucleicos, se usa para la cosmética en cremas, geles y bronceadores y en anestesia local permitiendo la liberación lenta del principio activo.

Liposomas

Aplicaciones

24

Son polímeros naturales derivados de organismos vivos como plantas y microorganismos. Pueden ser producidos por plantas, animales, bacterias, hongos, levaduras y otros organismos, liberando productos como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN), las proteínas, la celulosa, la quitina , el almidón, etc. Como recursos renovables, la principal ventaja de los biopolímeros sobre los polímeros derivados de combustibles fósiles es su sostenibilidad potencial, particularmente cuando la biodegradación combinada es una función necesaria del microorganismo nanoencapsulado por ejemplo, para aplicaciones industriales o en la agricultura.

Biopolímeros

características

25

Los biopolímeros son conjuntos de fragmentos monoméricos que forman una partícula capaz de encapsular un medicamento o un gen el cual termina transportandoa un objetivo diana. Este a su vez cuenta con un recubrimeinto superficial para mejorar la penetración de la partícula (imagen izquierda). Cuando un biopolímero que funciona como vector, se le adiciona un ácido nucleico, este pasa a convertirse en un Polyplex (imagen derecha).

Biopolímeros

Estructura y compoenentes

26

Los biopolímeros se pueden encontrar en diversas conformaciones ya sean helicoidales, beta plegadas, cadena extendida entre otros. Estas conformaciones pueden darse ya sea por la propia estructura o al adicionarle agentes que mejoren su viabilidad como la PolyLis o el PEG que generan Lipopoliplex en conformaciones de Panque, Hongo y Cepillo. Esto ocurre en los PEG por el entrecruzamiento de los lípidos en la capa del polímero como anclaje.

Biopolímeros

Estructura y compoenentes

27

Método de colada por solventeConsiste en crear una mezcla acuosa o hidroalcohólica con la presencia del biopolímero. Este método se basa en el uso de un solvente que permite suspender el polímero en una solución formadora de película seguida de la evaporación del solvente y la reformulación de la cadena polimérica. La mezcla polímero-solvente se vierte en un molde, tambor o superficie plana, donde se deja secar durante un tiempo específico. Una vez que el solvente se evapora completamente, se forma la matriz polimérica y se puede despegar del molde.Otros métodos son el de recubrimiento, electrohilado, impresión 3D, extrusión y copolimerización.

Biopolímeros

Método de producción

28

ventajas

En el caso de biopolímeros naturales

• Son renovables
• No tóxicos
• biodegradables
• Biofuncionales

desventajas

• Menor estabilidad
• Bajo punto de fusión
• Alta tensión superficial
• Estructura más compleja

Biopolímeros

29

Los biopolímeros tanto naturales como sintéticos tienen aplicabilidad en:

• Industria médica
• Materiales
• Automotriz
• Aviación
• Alimentos
• Fármacos
• Entre otros

Biopolímeros

Aplicaciones

30

dendrimeros

características

1. Es una macromolecula polimerica.
2. Posee un solo peso molecular.
3. Al igual tiene múltples brazos monoméricos.

• Griego - Dendrón = árbol

Posee dos rutas de construcción:

• Ruta Divergente

Núcleo - Rama - Dendrón (última capa)

• Ruta Convergente

Dendrón - Ramas - Núcleo

31

• "Son cargados"
• Con drogas o marcadores radioactivos
• Con Químicos distintos

APLICACIONES

Dendrimeros

VENTAJAS

1. Múltples receptores
2. Robusta construcción covalente
3. Extremo control en la estructura y tamaño
4. Toxicidad baja ya sea in vitro o in vivo

datos interesantes

> Entrada en la célula vía raft-depediente (o Endocitosis)> Inhibe nucleasas dependientes de pH> Mayor tamaño celular - Es viceversa con mayor toxicidad de la molécula.> Transfección del 50%

Vectores Virales

Terapia Génica

Promotores como; p5, p19, p40, IX, VA-RNA, IVa2

Gen de la cápside

Gen de la replicación

cap

rep

Proteínas de envoltura

Transcriptasa reversa

proteína de la cápside

env

pol

gag

Genes estructurales

Estructura general

33

Sitios splicing

Sitio de polipurinas

Señal de empaquetamiento

Requerida para la transcripción reversa

Requerida para la transcripción reversa

región 5´U3 , región R y región 3´U5

RRE

PPT

SD/SA

PBS

LTR

Estructura de los vectores virales y sus genes

34

Vector gammaretroviral

ventajas

• Transfección estable y constitutiva
• El vector solo es capaz de tener un solo ciclo de replicación.
• Integración en la célula huésped

desventajas

• Bajas concentraciones
• Mutagenesis (oncogenes)
• Solo realiza transfección a células en división
• Silenciamiento de la expresión génica

35

env

pol

SA

SD

gag

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

Estructura del vector gammaretroviral

2 genes con una proteína de fusión

2 genes con una secuencia IRES interno (Sitio de entrada ribosómica interna)

2 genes con un promotor interno

2 genes, splicing alternativo

Transcripción de un solo gen con 5´LTR

Un solo gen con promotor interno

gene 1

gene 2

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

IRES

gene 1

gene 2

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

gene 1

gene 2

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

gene 1

SA

SD

gene 2

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

Variantes

gene 1

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

SA

SA

SD

gen terapeutico

SD

Genoma del gammaretrovirus (8kb)

gene 1

PPT

PPT

PBS

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

5´´ ltr

Vectores

36

Vector lentiviral

ventajas

• Amplio espectro de infección
• Infecta tanto células en división como células que no lo están (neuronas) ya sea en in vitro e in vivo.
• Alta seguridad por su deficiente replicación
• Integración estable en el genoma del huésped y expresión estable del transgén.
• No se generan proteínas inmunogénicas

desventajas

• Necesita un pseudotipo (VSV-G)
• Posible mobilización del vector en pacientes con HIV -Potencial de generación de RCL
• Potencial de mutagénesis insercional

37

3.- VSV-G

1.- Transgén

2.- Empaquetamiento

vif

RRE

tat

rev

SA

RRE

PPT

SD

PBS

gen terapeutico

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

Poly A

SA

SD

CMV

VSV-G

1era generación

nef

HIV-1 genoma del lentivirus 8.7kb

vif

nef

Poly A

RRE

PPT

vpu

vpr

tat

rev

env

pol

gag

SA

SD

CMV

PPT

SD

PBS

vpu

vpr

env

pol

gag

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

genoma del lentivirus

38

3° Rev

4°- VSV-G

2°- Empaquetamiento

1°- Transgén

3.- VSV-G

1.- Transgén

2.- Empaquetamiento

3era Generación

2da Generación

Poly A

SA

SD

CMV

VSV-G

Poly A

env

pol

gag

SA

SD

CMV

Poly A

Poly A

Poly A

RRE

tat

rev

env

pol

gag

SA

SD

CMV

cPPT

SA

RRE

PPT

SD

PBS

gen terapeutico

R/U5

R/U5

RSV

SA

SA

SD

RRE

PPT

SD

PBS

CMV

VSV-G

RSV

rev

gen terapeutico

U3/R/U5

U3/R/U5

3´ ltr

5´´ ltr

Vectores de lentivirus

39

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DESvENTAJAS

ADENOVIRUS

vENTAJAS

1. Se puede lograr una concentración del orden 1x10 (13) p/mL.
2. No se integra al genoma del huésped (alta seguridad).
3. La capacidad, siempre y cuando se de uso de los vectores de segunda y tercera generación.
4. Altos niveles de expresión.
5. La facilidad de amplificación reduce significativamente los costos.
6. Infección en células en no división y en división

• Se tiene una respuesta inmune o inflamatoria elevada.
• Trasnfección transitoria.
• Del 80 al 90% del vector es totalmente eliminado en un lapso de 24 horas.
• De 4 a 7 días se da una respuesta de adaptación, por lo que no se puede dar una re-administración.
• De 30-40% de las personas de países del este y del 80 al 90% de Africa poseen anticuerpos anti-Ad5.

40

36kb

5´

3´

5´

3´

e3

e1a

e1B

mlp

l5

l4

l3

l2

l1

e4

e2b

e2a

IVa 2

va rna I & II

ix

itr

itr

Genoma del Adenovirus

Vector

41

Tercera generación

35 - 37 kb

9 - 14 kb

5 - 8 kb

E4

E3

E2

E1

E3

E1

Gen terapeutico

Stuffer DNA

Gutless

Segunda generación

itr

itr

l5

l4

l3

l2

l1

IVa 2

va rna

ix

itr

itr

l5

l4

l3

l2

l1

e4

e2b

e2a

IVa 2

va rna

ix

itr

itr

Primera generación

generaciones del vector adenoviral

Transfección a células HEK 293

42

Purificación del DNA viral

ITR

Recombinación

ITR

E1

E1

Ecsición por Enzima de restricción

E1

ITR

ITR

Ad 2 o Ad 5

E1

ITR

Gen terapeutico

ITR

Gen terapeutico

Linearización

ITR

ITR

Vector adenovirus

2 plásmidos - Shuttle vector

MÉTODOS DE PRODUCCION

ori

Amp R

ITR

43

Plasmido con el genoma de adenovirus (ITRs , Señal de empaquetamiento)

ori

Amp R

ITR

ITR

E1

Transfección a células HEK 293

ITR

Recombinación

ITR

E1

E1

Gen terapeutico

ITR

Gen terapeutico

Linearización

ITR

Vector adenovirus

Shuttle vector

MÉTODOS DE PRODUCCION

44

Transformación y Linearización

Plasmido con el genoma de adenovirus (ITRs , Señal de empaquetamiento)

loxP

Gen terapeutico

Cm (R)

loxP

E1

Cm (R)

loxP

Gen terapeutico

loxP

ori

Amp R

ITR

ITR

E1

Cm (R)

loxP

Plasmido con secuencias loxP mutadas, el gen terapeutico (promotor, polyA) y el gen de resistencia a antibiótico

ori

Amp R

ITR

ITR

E1

Transfección a células HEK 293

ITR

ITR

Gen terapeutico

Recombianción con Cre recombinasa in vitro

loxP

Vector adenovirus

por cre recombinasa

MÉTODOS DE PRODUCCION

45

Gen terapeutico

itr

itr

Producción de proteínas de replicación y empaquetamiento

Virus helper sin la señal de empaquetamiento

Vector con DNAy señal de empaquetamiento

Cre recomibanasa

E1

ITR

ITR

loxP

ITR

ITR

loxP

E1

loxP

ITR

ITR

Helper virus

loxP

E1

Gen terapeutico

Gutless vector

itr

itr

Célula con Cre recomibanasa

Plasmido con el genoma de adenovirus (ITRs , Señal de empaquetamiento)

Transfección a células HEK 293

loxP

Vector adenovirus

Producción del gutless vector

MÉTODOS DE PRODUCCION

46

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dESvENTAJAS

ADENOVIRUS ADENOASOCIADOS (aav)

vENTAJAS

• No producen respuesta inmune o inflamatoria
• Expresión va de meses a años (persistente y estable).
• Gran tropismo con otros tejidos (mosaico de cápsides)

• Producción de altas concentraciones
• Amplia gama de hospedadores
• Posee un genoma simple
• No tiene problemas con los promotores
• Infección en células en no división y en división

1. Tamaño de empaquetamiento limitado (5kb).
2. Dependen de otro virus (helper virus) para su replicación y autonomía.
3. Al tener pre-inmunidad el transgen se elimina a los primeros días de ser administrado.
4. Tropismo limitado

47

An

An

An

An

-- estrUCTURA DEL vector del AAV

An

An

An

VP3

VP2

VP1

Rep 40

Rep 52

Rep 68

Rep 78

p5

AUG 2203

AUG 2614

AUG 2810

p19

p5

ITR

ITR

Poly A

-- caracteristicas del genoma de adenovirus adenoasociado

Cap

Rep

Promotor

Gen terapeutico

Pol y A

itr

genoma del adenovirus

itr

4.7kB

Promotor

Gen terapeutico

Pol y A

itr

48

itr

Recuperación y análisis

Purificación por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio

rAAV

LISIS CELULAR

células HEK 293

E4

E2A

VA-I RNA

vector helper

Transfección con fosfato de calcio

Adenovirus helper genes

cap

rep

producción del vector aav

plasmido + transgen

49

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