Ev1_483_TerapiaGénica

Universidad Autonoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Biológicas

Licenciatura en Biotecnología Genómica

Terapia génica

Evidencia 1

Dosier de vectores

Facilitador: Dra. Brenda Gonzalez Hernandez Equipo: Ponce Refugio Axel Gael - 1966002 Garnica Jiménez Edson jair - 1919444 Fecha : 13 / 09 / 2024

Vectores de Transferencia

En el ámbito biotecnológico y médico, los vectores son moléculas de ADN que contienen un inserto de ADN extraño que se utilizan para transportar el gen de interés al genoma de la células objetivo. Los vectores funcionan como vehículo para transportar una molécula o compuesto de interés. Por tal motivo son importantes en la investigación y tratamientos clíncios, ya que, permiten modificar células o tejidos específicos y transferir genes o medicamentos. Entre los vectores más comúnmente usados estan plásmidos, lípidos, nanopartículas y virus. Llegan a clasificarse en dos grandes grupos dependiendo de la técnica y el origen del vector: Vectores virales y no virales. En este trabajo se pretende describir a detalle cada uno de los tipos de vectores utilizados en la actualidad que son de importancia médica y biotecnológica.

ÍNDICE

Microinyección Características Estructura, Componentes y Método Ventajas y Desventajas Aplicaciones Biobalística Caracterísitcas Estructura, Componentes y Método Ventajas y Desventajas Aplicaciones Electroporación Características Estructura, Componentes y Método Ventajas y Desventajas Aplicaciones Nucleofección Características Estructura, Componentes y Método Ventajas y Desventajas Aplicaciones

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 2 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 4 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 6 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 8 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------9

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 10 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 11 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 12 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------13

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 14 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 14 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 15 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 16 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------17

ÍNDICE

LiposomasCaracte´risticas Estructura y Elementos Método de producción Ventajas y Desventajas Aplicaciones Biopolímeros Características Estructura y Elementos Método de producción Ventajas y Desventajas Aplicaciones Dendrímeros Características Ventajas Aplicaciones

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 18 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 19 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 21 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------22 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 23

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 24 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 25 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 27 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------28 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 30 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 30 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 31 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 31

ÍNDICE

Estrucutura de vectores virales Gammaretrovirus Ventajas y Desventajas Estructura de vectores Lentivirus Ventajas y Desventajas Estructura de vectores Adenovirus Ventajas y Desventajas Estructura de vectores Adenovirus Adenoasociados Ventajas y Desventajas Genoma del Adenovirus Producción del Vectro AVV Literatura

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---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 34 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 35

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 36 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 36 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 37

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 39 ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------ 39 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 40

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---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 49

Vectores No-Virales

Terapia Génica

Microinyección

características

Propiedades Microinyeccion

• • Alta eficacia de Transfección
• • Es una de las técnicas más usadas en invertebrados
• • Se usa ex vivo
• • Y en embriones in vivo
• • La eficacia de integración genica es del 30%

Método para inyectar mecánicamente células, material genético, péptidos, fármacos u otros agentes exógenos directamente en células o tejidos utilizando una pipeta muy pequeña. Consiste en la inserción del DNA mediante una inyección en el núcleo mediante un micromanipulador.

Microinyección

Método

Estructura y Componentes

1. Se prepara la micropipeta o aguja de vidrio calentandola hasta formar una punta fina de 0,5 mm de diámetro. 2. Las células a microinyectar se colocan en un recipiente. 3. Se coloca una pipeta de retención cerca de la célula objetivo. 4. La micropipeta de la muestra se monta en un micromanipulador. 5. La micropipeta se introduce en la membrana celular y se inyecta en la célula aplicando presión hidrostática con un microinyector. 6. Al final, la aguja de la micropipeta vacía se retira de la célula con lentitud y cuidado.

La microinyección hace uso de un microscopio que esta equipado con un inyector a presión (a), micromanipulador (c) y placa de microinyección (f) donde irá la muestra.

Al inyectar transgenes, se usa una pipeta de sujeción para sujetar el ovocito e insertarle el esperma mediante la aguja de inyección.

Microinyección

desventajas

ventajas

• No usa marcadores de selección
• Administración precisa de materiales en términos de volumen y tiempo
• Fácil identificación mediante coinyección de colorante
• Requiere menos preparación de proteínas en comparación con electroporación

• Experiencia técnica necesaria para dominar la microinyección
• Requiere mucho trabajo y tiempo
• Escalabilidad limitada
• No se complementa con pasos de Purificación y Western Blot

Microinyección

Aplicaciones

Aplicaciones de la microinyección y uso en terapia génica La microinyección tiene numerosas aplicaciones clínicas y de investigación, incluida la transfección de células mediante inyección de ADN, la fertilización mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), la introducción de células madre embrionarias modificadas genéticamente en un blastocisto, y más. Utilización de la microporyeción • Organismos transgenicos • Para introducir Rna antisentido • Eficaz para introducir DNA en la piel

Biobalística

características

Propiedades de la biobalísitca

• De eficacia variable y expresión transitoria
• Integración solo de 10-8
• Se usa tanto I vitro como in vivo
• Es de fácil manejo
• Integraciones múltiples
• Produce muerte celular

Método para introducir ADN en las células por medio de partículas microscópicas (micropartículas) aceleradas a velocidades supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. permite manipular cualquier tipo de célula haciendo uso de microproyectiles de 1um a 20um de tamaño.

Biobalística

Estructura y componentes

Método

• El equipo de biobalística funciona con gas helio a alta presión que se concentra en una cámara de presurización.
• La onda de choque se libera perforando unas membranas denominadas membranas de ruptura.
• El gas liberado impulsa las micropartículas recubiertas con el ADN, las cuales impactan en el tejido vegetal a transformar o explanto.
• La cámara con el material vegetal se encuentra en condiciones de vacío parcial para reducir la fuerza de rozamiento del aire.
• Las partículas recubiertas por el ADN o gen de interés, se acompañan de otras secuencias (promotor y terminador) y genes, facilitando la inserción en el genoma de la célula receptora

Para este método se emplea un cañon génico, el más usado el PDS/1000He (izquierda), el cual cuenta con una cámara principal donde se bombardea la muestra mediante la liberación de helio comprimido que dispara los micropoyectiles a gran velocidad (centro). La alternativa al cañon es la pistola de genes de mano que trabaja sin vacío y puede manipular hasta organismos vivos (derecha)

Biobalística

desventajas

ventajas

• Transforma células de manera directa y al azar
• Inserta genes en el núcleo celular
• Requiere menos preparación de proteínas en comparación con electroporación
• Permite la transformación específica de cualquier tejido y tipo de célula

• Sistema costoso
• Requiere equipo especializado
• Es necesario conocimiento técnico especializado en el método

Biobalística

Aplicaciones

Se usa principalmente para la producción de organismos transgénicos y muy usado en modificación de células vegetales. También se ha usado como coadyuvante para tratamientos de cáncer. Uso de la biobalística • Protocolos de vacunación • Transformación de células vegetales • Creación de plantas transgenicas : monlcotiledoneas (maíz y arroz) y dicotiledoneas (soya, tabaco y algodón)

Electroporación

características

Fenómeno físico que determina la permeabilización de las membranas celulares a través de la aplicación de impulsos eléctricos. Puede ser reversible cuando la permeabilización es temporal o irreversible cuando comporta la muerte celular después de un daño irreparable de la membrana celular. También es llamada electropermeabilización o electrotransferencia.

La Eficacia de la electroporación va depender de: • Intensidad del campo eléctrico • La impedancia específica del tejido • Longitud y número de pulsos • Forma, tamaño, arquitectura y tipo de electrodos • El buffer utilizado • Tamaño de la célula

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Electroporación

Estructura y componentes

Método

• Se agrega un plásmido a un cultivo de células competentes las cuales se incuban en hielo por 20 min.
• Luego se realiza una electroporación a 175V/cm durante intervalos de 5ms
• Se adiciona medio LB y se centrifuga
• Se elimina el medio y se siembra y cultiva el sobrenadante a 37°C toda la noche
• Se obtienen clonas recombinantes

En un electroporador se ingresa una cubeta la cual contendrá la muestra. Esta cubeta estará rodeada deunos electrodos los cuales enviarán los pulsos eléctricos que permitirán que la membrana de la muestra sea ma´s permeable. Los pulsos tienen una carga de 200V/cm y se realizan en intervalos de aproximadamente 5ms.

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Electroporación

desventajas

ventajas

• Require desenganchar células del sustrato
• Mortalidad celular alta
• Se tiene que ajustar condiciones para cada tipo celular

• Técnica simple
• Es reporducible
• Gran eficacia

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Electroporación

Aplicaciones

En la medicina, la electroporación se usa para: • Manipulación genética y modificación del ADN celular • Tratamiento de tumores • Terapias génicas • Administración de medicamentos a través de la piel • Ensayos de permeabilidad celular • Estudios de liberación controlada de medicamentos

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Nucleofección

características

Tecnología de electroporación mejorada introducida por Amaxa en 2001 que utiliza una combinación de parámetros eléctricos y soluciones específicas para cada tipo celular que permite la transferencia de una molécula directamente al núcleo de las células. Gracias a que es un método independiente de la propia proliferación celular, la nucleofección permite transfectar de forma eficiente incluso células primarias que no se dividen (como las células T o neuro)

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Nucleofección

Método

EQuipo y Elementos

La nucleofección utiliza una combinación de parámetros eléctricos, generados por un dispositivo llamado Nucleofector, con reactivos específicos de tipo celular. El sustrato se transfiere directamente al núcleo celular y al citoplasma. Por el contrario, otros métodos de transfección no viral de uso común se basan en la división celular para la transferencia de ADN al núcleo. Por tanto, la nucleofección proporciona la capacidad de transfectar incluso las células que no se dividen, como las neuronas y las células sanguíneas en reposo.

Para llevar a cabo la nucleofección se utilizan equipos especiales como el 4D nucleofector o el shuttle de 96 pocillos de la compañia Lonza. Estos equipos vienen con kits especiales y protocolos optimizados para cada tipo celular que la misma compañia brinda.

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Nucleofección

desventajas

ventajas

• Requiere reactivos de Lonza
• Equipos costosos
• Mortalidad celular en condiciones óptimas
• Se desconoce formulación de tampones
• Parámetros de los programas no son manipulables por el usuario

• Alta eficiencia de transfección
• Excelente preservación
• Fácil de usar
• Análisis a las pocas horas
• Mínimo riesgo de contaminación
• Escalado flexible

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Nucleofección

Aplicaciones

Se utiliza para transfectar células primarias, neuronas, líneas celular y células madre. Puede utilizarse en edición de CRISPR, terapia génica, generación de iPSC e inmunoterapia. También en aplicaciones ex vivo de terapia génica

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Liposomas

Características

Son pequeñas partículas parecidas a la grasa que se producen en laboratorio. Están compuestos por fosfolípidos, la misma molécula que predomina en las membranas de las células. Son vesículas artificiales que se usan en la medicina y la cosmética para transportar sustancias como medicamentos, genes y etiquetas de imagenología médica.

18

Liposomas

Estructura y componentes

La partícula liposomal básica se compone de una cabeza hidrófila, la membrana de fosfolípidos y una colo lipófila. En su interior se coloca el gen o componente de interés que transportará.

1era Gen Convencional

2da Gen Pegilado

Un liposoma al cual se le adiciona un ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, para transportar a un tejido diana, se le conoce como lipoplex. El cual se clasifica en: de membrana, micela y encapsulamiento y se caracteriza por poder liberar el contenido en el citoplasma.

3era Gen con Ligando

Lípido-Nanopartícula

De acuerdo a su evolución también se clasifican en 1era, 2da y 3era generación. La última se llama Liposfera.

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Liposomas

Estructura y componentes

También de acuerdo a la estructura membranal o si están cargados con algún agente como PEG, se consideran Catiónicos, Neutrales o Aniónicos.

De acuerdo al componente que acarrean podemos encontrar otra clasificacio´n, donde encontramos los cubosomas, los liposomas cargados de fármaco, los sólidos y los silenciosos.

20

Liposomas

Método de producción

De acuerdo con el ejemplo de Bayas y Brito 2009: Los liposomas se prepararon utilizando Fosfatidilcolina de soya (Soy Phosphatidilcholine o PC) y colesterol 1. Preparación de soluciones base de PC y colesterol. 2. Preparación de mezclas de PC y Colesterol. 3. Evaporación del solvente de las mezclas PC- Colesterol. 4. Hidratación del lípido seco. 5. Uso de ultrasonido para inducir la formación de liposomas en la solución acuosa. 6. Extrusión de la solución de liposomas. Para obtener liposomas de tamaño nanométrico, la solución primaria se sometió a extrusión a través de una membrana de policarbonato con tamaño de poro de 100 nm

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Liposomas

desventajas

ventajas

• Incremento en la eficacia e índice terapeútico en el área médica
• Aumentan estabilidad po encapsulación
• Son atóxicos
• Reducen la toxicidad de agentes encapsulados
• Son flexibles y sitio específicos

• Baja solubilidad
• Tiempo de vida relativamente corto
• Químicamente inestable
• Costo elevado

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Liposomas

Aplicaciones

Se utilizan para el transporte de fármacos, de ácidos nucleicos, se usa para la cosmética en cremas, geles y bronceadores y en anestesia local permitiendo la liberación lenta del principio activo.

23

Biopolímeros

características

Son polímeros naturales derivados de organismos vivos como plantas y microorganismos. Pueden ser producidos por plantas, animales, bacterias, hongos, levaduras y otros organismos, liberando productos como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN), las proteínas, la celulosa, la quitina , el almidón, etc. Como recursos renovables, la principal ventaja de los biopolímeros sobre los polímeros derivados de combustibles fósiles es su sostenibilidad potencial, particularmente cuando la biodegradación combinada es una función necesaria del microorganismo nanoencapsulado por ejemplo, para aplicaciones industriales o en la agricultura.

24

Biopolímeros

Estructura y compoenentes

Los biopolímeros son conjuntos de fragmentos monoméricos que forman una partícula capaz de encapsular un medicamento o un gen el cual termina transportandoa un objetivo diana. Este a su vez cuenta con un recubrimeinto superficial para mejorar la penetración de la partícula (imagen izquierda). Cuando un biopolímero que funciona como vector, se le adiciona un ácido nucleico, este pasa a convertirse en un Polyplex (imagen derecha).

25

Biopolímeros

Estructura y compoenentes

Los biopolímeros se pueden encontrar en diversas conformaciones ya sean helicoidales, beta plegadas, cadena extendida entre otros. Estas conformaciones pueden darse ya sea por la propia estructura o al adicionarle agentes que mejoren su viabilidad como la PolyLis o el PEG que generan Lipopoliplex en conformaciones de Panque, Hongo y Cepillo. Esto ocurre en los PEG por el entrecruzamiento de los lípidos en la capa del polímero como anclaje.

26

Biopolímeros

Método de producción

Método de colada por solvente Consiste en crear una mezcla acuosa o hidroalcohólica con la presencia del biopolímero. Este método se basa en el uso de un solvente que permite suspender el polímero en una solución formadora de película seguida de la evaporación del solvente y la reformulación de la cadena polimérica. La mezcla polímero-solvente se vierte en un molde, tambor o superficie plana, donde se deja secar durante un tiempo específico. Una vez que el solvente se evapora completamente, se forma la matriz polimérica y se puede despegar del molde. Otros métodos son el de recubrimiento, electrohilado, impresión 3D, extrusión y copolimerización.

27

Biopolímeros

desventajas

ventajas

• Menor estabilidad
• Bajo punto de fusión
• Alta tensión superficial
• Estructura más compleja

En el caso de biopolímeros naturales

• Son renovables
• No tóxicos
• biodegradables
• Biofuncionales

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Biopolímeros

Aplicaciones

Los biopolímeros tanto naturales como sintéticos tienen aplicabilidad en:

• Industria médica
• Materiales
• Automotriz
• Aviación
• Alimentos
• Fármacos
• Entre otros

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dendrimeros

características

1. Es una macromolecula polimerica.
2. Posee un solo peso molecular.
3. Al igual tiene múltples brazos monoméricos.

• Griego - Dendrón = árbol

Posee dos rutas de construcción:

• Ruta Divergente

Núcleo - Rama - Dendrón (última capa)

• Ruta Convergente

Dendrón - Ramas - Núcleo

30

Dendrimeros

datos interesantes

VENTAJAS

> Entrada en la célula vía raft-depediente (o Endocitosis)> Inhibe nucleasas dependientes de pH> Mayor tamaño celular - Es viceversa con mayor toxicidad de la molécula. > Transfección del 50%

1. Múltples receptores
2. Robusta construcción covalente
3. Extremo control en la estructura y tamaño
4. Toxicidad baja ya sea in vitro o in vivo

APLICACIONES

• "Son cargados"
• Con drogas o marcadores radioactivos
• Con Químicos distintos

31

Vectores Virales

Terapia Génica

Estructura de los vectores virales y sus genes

Estructura general

Genes estructurales

gag

proteína de la cápside

LTR

región 5´U3 , región R y región 3´U5

pol

PBS

Requerida para la transcripción reversa

Transcriptasa reversa

Proteínas de envoltura

env

SD/SA

Sitios splicing

rep

Gen de la replicación

PPT

Sitio de polipurinas

Gen de la cápside

cap

Señal de empaquetamiento

RRE

Requerida para la transcripción reversa

Promotores como; p5, p19, p40, IX, VA-RNA, IVa2

33

Vector gammaretroviral

ventajas

desventajas

• Transfección estable y constitutiva
• El vector solo es capaz de tener un solo ciclo de replicación.
• Integración en la célula huésped

• Bajas concentraciones
• Mutagenesis (oncogenes)
• Solo realiza transfección a células en división
• Silenciamiento de la expresión génica

34

Vectores

5´´ ltr

3´ ltr

U3/R/U5

U3/R/U5

PBS

PPT

Genoma del gammaretrovirus (8kb)

gen terapeutico

SD

SA

Estructura del vector gammaretroviral

5´´ ltr

3´ ltr

U3/R/U5

U3/R/U5

PBS

PPT

gag

SD

SA

pol

env

Variantes

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

PPT

gene 1

Transcripción de un solo gen con 5´LTR

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

2 genes con un promotor interno

gene 2

gene 1

3´ ltr

5´´ ltr

SD

SA

3´ ltr

5´´ ltr

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

Un solo gen con promotor interno

gene 1

PPT

IRES

PBS

2 genes con una secuencia IRES interno (Sitio de entrada ribosómica interna)

U3/R/U5

U3/R/U5

gene 2

gene 1

3´ ltr

5´´ ltr

3´ ltr

5´´ ltr

PPT

PBS

U3/R/U5

U3/R/U5

gene 1

2 genes, splicing alternativo

gene 2

PPT

U3/R/U5

PBS

U3/R/U5

gene 2

2 genes con una proteína de fusión

gene 1

3´ ltr

5´´ ltr

SA

SD

3´ ltr

35

5´´ ltr

Vector lentiviral

desventajas

ventajas

• Amplio espectro de infección
• Infecta tanto células en división como células que no lo están (neuronas) ya sea en in vitro e in vivo.
• Alta seguridad por su deficiente replicación
• Integración estable en el genoma del huésped y expresión estable del transgén.
• No se generan proteínas inmunogénicas

• Necesita un pseudotipo (VSV-G)
• Posible mobilización del vector en pacientes con HIV -Potencial de generación de RCL
• Potencial de mutagénesis insercional

36

genoma del lentivirus

HIV-1 genoma del lentivirus 8.7kb

RRE

PBS

PPT

rev

U3/R/U5

gag

U3/R/U5

vif

tat

5´´ ltr

3´ ltr

pol

env

nef

SD

vpu

vpr

1era generación

PBS

PPT

RRE

U3/R/U5

U3/R/U5

1.- Transgén

5´´ ltr

3´ ltr

gen terapeutico

SD

SA

RRE

PPT

Poly A

rev

gag

tat

2.- Empaquetamiento

vif

CMV

nef

pol

env

SD

SA

vpu

vpr

37

Poly A

CMV

VSV-G

3.- VSV-G

SD

SA

Vectores de lentivirus

3era Generación

2da Generación

1°- Transgén

1.- Transgén

PBS

RRE

cPPT

PPT

PBS

PPT

R/U5

RRE

R/U5

U3/R/U5

U3/R/U5

5´´ ltr

3´ ltr

gen terapeutico

RSV

gen terapeutico

SA

SD

SA

SD

Poly A

2°- Empaquetamiento

RRE

gag

2.- Empaquetamiento

Poly A

CMV

rev

env

pol

gag

tat

CMV

SD

SA

pol

env

SD

SA

Poly A

3° Rev

rev

RSV

Poly A

3.- VSV-G

Poly A

CMV

VSV-G

4°- VSV-G

CMV

VSV-G

SD

SA

SD

SA

38

ADENOVIRUS

DESvENTAJAS

vENTAJAS

1. Se puede lograr una concentración del orden 1x10 (13) p/mL.
2. No se integra al genoma del huésped (alta seguridad).
3. La capacidad, siempre y cuando se de uso de los vectores de segunda y tercera generación.
4. Altos niveles de expresión.
5. La facilidad de amplificación reduce significativamente los costos.
6. Infección en células en no división y en división

• Se tiene una respuesta inmune o inflamatoria elevada.
• Trasnfección transitoria.
• Del 80 al 90% del vector es totalmente eliminado en un lapso de 24 horas.
• De 4 a 7 días se da una respuesta de adaptación, por lo que no se puede dar una re-administración.
• De 30-40% de las personas de países del este y del 80 al 90% de Africa poseen anticuerpos anti-Ad5.

39

Leer más

Vector

Genoma del Adenovirus

36kb

l5

l4

e1B

l3

l2

e1a

e3

l1

ix

mlp

va rna I & II

5´

itr

itr

3´

3´

5´

e4

e2a

IVa 2

e2b

40

generaciones del vector adenoviral

Primera generación

5 - 8 kb

l5

l4

l3

l2

l1

ix

va rna

E1

E3

itr

itr

e4

e2a

IVa 2

e2b

Tercera generación

9 - 14 kb

Segunda generación

l5

l4

l3

Gutless

35 - 37 kb

l2

l1

ix

va rna

E1

E3

E4

E2

itr

itr

Stuffer DNA

itr

itr

IVa 2

Gen terapeutico

41

Vector adenovirus

MÉTODOS DE PRODUCCION

2 plásmidos - Shuttle vector

Gen terapeutico

Ad 2 o Ad 5

ITR

Purificación del DNA viral

E1

E1

ITR

ITR

Linearización

Ecsición por Enzima de restricción

E1

Gen terapeutico

ITR

ITR

ITR

E1

Transfección a células HEK 293

ITR

Recombinación

ITR

42

Vector adenovirus

MÉTODOS DE PRODUCCION

Shuttle vector

Gen terapeutico

Plasmido con el genoma de adenovirus (ITRs , Señal de empaquetamiento)

ITR

E1

Amp R

ori

ITR

ITR

Linearización

E1

Gen terapeutico

ITR

E1

Transfección a células HEK 293

Amp R

ori

ITR

ITR

Recombinación

ITR

43

Vector adenovirus

MÉTODOS DE PRODUCCION

por cre recombinasa

Plasmido con el genoma de adenovirus (ITRs , Señal de empaquetamiento)

ITR

ITR

Amp R

loxP

Plasmido con secuencias loxP mutadas, el gen terapeutico (promotor, polyA) y el gen de resistencia a antibiótico

loxP

ori

Gen terapeutico

E1

Cm (R)

Recombianción con Cre recombinasa in vitro

loxP

Gen terapeutico

loxP

Cm (R)

ITR

ITR

Amp R

ori

E1

Transformación y Linearización

Transfección a células HEK 293

loxP

Gen terapeutico

loxP

Cm (R)

44

ITR

ITR

E1

Vector adenovirus

MÉTODOS DE PRODUCCION

Producción del gutless vector

Plasmido con el genoma de adenovirus (ITRs , Señal de empaquetamiento)

Helper virus

Gutless vector

loxP

loxP

itr

itr

ITR

ITR

E1

Gen terapeutico

Célula con Cre recomibanasa

Transfección a células HEK 293

Cre recomibanasa

Vector con DNAy señal de empaquetamiento

itr

itr

loxP

loxP

ITR

ITR

Gen terapeutico

E1

loxP

Virus helper sin la señal de empaquetamiento

ITR

ITR

E1

Producción de proteínas de replicación y empaquetamiento

45

ADENOVIRUS ADENOASOCIADOS (aav)

vENTAJAS

dESvENTAJAS

• No producen respuesta inmune o inflamatoria
• Expresión va de meses a años (persistente y estable).
• Gran tropismo con otros tejidos (mosaico de cápsides)

• Producción de altas concentraciones
• Amplia gama de hospedadores
• Posee un genoma simple
• No tiene problemas con los promotores
• Infección en células en no división y en división

1. Tamaño de empaquetamiento limitado (5kb).
2. Dependen de otro virus (helper virus) para su replicación y autonomía.
3. Al tener pre-inmunidad el transgen se elimina a los primeros días de ser administrado.
4. Tropismo limitado

Leer más

46

genoma del adenovirus

4.7kB

-- caracteristicas del genoma de adenovirus adenoasociado

AUG 2203

Poly A

AUG 2614

p5

p5

p19

AUG 2810

ITR

ITR

Rep

Cap

Rep 78

An

Rep 68

An

Rep 52

An

Rep 40

An

VP1

An

VP2

An

An

VP3

-- estrUCTURA DEL vector del AAV

itr

itr

Pol y A

Gen terapeutico

Promotor

47

producción del vector aav

plasmido + transgen

vector helper

rep

cap

itr

itr

Pol y A

Gen terapeutico

Promotor

VA-I RNA

E2A

E4

Adenovirus helper genes

Transfección con fosfato de calcio

células HEK 293

LISIS CELULAR

Purificación por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio

rAAV

48

Recuperación y análisis

Referencias bibliográficas

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