5y6_Tuberculosis

¡Iniciemos esta ruta de aprendizaje!

¡Creciendo juntos!

Mycobacterium tuberculosis

(Núm. Cat. TB7301Y)

Kit Anyplex II - MTB/MDR Detection

Tema 5

1/34

En ANNAR Health Technologies existen dos kits para el diagnóstico Molecular de MTB del proveedor Seegene:

• Kit Anyplex II MTB/MDR detection: Para la detección de Tuberculosis y resistencia a medicamentos de primera línea (Núm. Cat. TB7301Y)
• Kit Anyplex II MTB/MDR/XDR detection: Para la detección de Tuberculosis y resistencia a medicamentos de primera y segunda línea(Núm. Cat. TB7500Y)

Mycobacterium

2/34

Mycobacterium tuberculosis: Diagnóstico Molecular a través de los kits MTB/MDR y MTB/XDR de Seegene

Para cada uno se los Kit, MDR/MTB y MDR/XDR/MTB debe utilizarse la versión actualizada del inserto de Seegene y seguir estrictamente todas las indicaciones

Destine materiales y equipamiento a estaciones de trabajo separadas y no los mueva de una zona a otra y abra tiras o tubos de reacción de PCR después de la amplificación solo en las zonas destinadas para ello, de modo que se evite la contaminación de la zona con los amplicones

Todos los reactivos deben ser descongelados en cadena de frio y realizar una breve centrifugación o spin down.

Deben adoptarse los procedimientos de seguridad de laboratorio al manipular las muestras utilice protección respiratoria adecuada. Limpie y desinfecte exhaustivamente todas las superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0,5 % (en agua desionizada o destilada).

La sensibilidad del test se reduce cuando las muestras son expuestas a varios ciclos de congelación/descongelación

El flujo de trabajo del laboratorio debe desarrollarse de manera Unidireccional. No mezcle reactivos de diferentes lotes o de diferentes tubos del mismo lote ni use los reactivos una vez finalizada su fecha de caducidad

3/34

Recomendaciones generales para la detección molecular de Micobacterium No tuberculosas mediante el Kit MTB/NTMe

Micropipetas de volumen variable

Termociclador CFX96

Termobloque

Centrifuga para microtubos

Cabina de seguridad Biológica Tipo II, exclusivo para manipulación de muestras y DNA

Es obligatorio el uso de tubo de PCR [tiras de 8 tubos de pared fina de 0,1 mL europeas (núm. cat. B77009) y las 8 tapas con muesca acoplable europeas (núm. cat. B79501) BIOplastic

Puntas con filtro y tubos eppendorf libres de RNAsas y DNAsas

Vortex

4/34

Equipos y consumibles requeridos para el procesamiento de los kits MTB/MDR y MTB/XDR de Seegene

Haz clic sobre la imagen para ampliarla

Es obligatorio el uso de tubo de PCR [tiras de 8 tubos de pared fina de 0,1 mL europeas (núm. cat. B77009) y las 8 tapas con muesca acoplable europeas (núm. cat. B79501) BIOplastic

Consumibles para pruebas de tuberculosis ​| Marca Bioplastics

Consumibles para Pruebas de Tuberculosis

5/34

Has clic en el botón para descargar el documento

Haz clic sobre la imagen para ampliarla

El manejo preanalítico de las muestras incluyendo el pretratamiento de estas debe realizarse siguiendo las indicaciones de esta guía

6/34

Recomendaciones para el pretratamiento de las muestras

Tecnología para la lectura de PCR en tiempo real, multiplexada, basada en el análisis de temperatura de Melting. Proporcionando capacidades de multiplexado mejoradas, flexibilidad del diseño de la sonda, facilitando una lectura independiente de la variación de la secuencia objetiva y una compatibilidad de la plataforma cruzada.

Evita la extensión de los moldes no específicamente cebados, permitiendo así el diseño y desarrollo de los ensayos con una especificidad excepcionalmente alta

Tecnología TOCE™

Tecnología DPO™ (dual priming oligonucleotide)

Ha desarrollado dos tecnologías aplicables a sus productos de PCR.

7/34

Tecnología desarrollada por Seegene para los Kits MDR/MTB y XDR/MTB

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla y clic en cada número para más información

Tecnología DPO™ (dual priming oligonucleotide)

8/34

Tecnología desarrollada por Seegene para los Kits MDR/MTB y XDR/MTB

Tecnología DPO™ (dual priming oligonucleotide)

9/34

Actividad

Haz clic sobre la imagen para ampliarla y clic en el botón morado para más información

La actividad de la nucleasa 5' escinde específicamente cuando el Pitcher esta unido a la secuencia objetivo, liberando esta secuencia para que se hibride con el Catcher, que tiene una secuencia complementaria a la región marcada. La formación de esta región dúplex induce la extensión de la secuencia objetivo, lo que da como resultado la generación de una señal de fluorescencia, por la separación del quencher. La señal se puede analizar mediante análisis en tiempo real o mediante análisis de curvas de fusión.

Principios de la Tecnología TOCE:Esta tecnología incluye los cebadores Pitcher y Catcher DPO. Donde el Pitcher es un oligonucleótido marcador que se hibrida específicamente con la región objetivo y el Catcher es una plantilla artificial doblemente etiquetado

La tecnología TOCE™ permite detectar y diferenciar múltiples objetivos mediante temperaturas Melt. en un solo tubo y permite proporcionar resultados cuantitativos mediante análisis CMTA cíclico.

Tecnología TOCE™

10/34

Tecnología desarrollada por Seegene para los Kits MDR/MTB y XDR/MTB

Tecnología desarrollada por Seegene para los Kits MDR/MTB y XDR/MTB

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Has clic en el botón para más información

La tecnología TOCE™ permite detectar y diferenciar múltiples objetivos mediante temperaturas Melting (TM)

El receptor está diseñado para tener una TM cuando la secuencia objetivo existe en la muestra, este valor de TM único esperado se obtiene al hacer el análisis de curvas melting. El valor de TM se controla ajustando la longitud y secuencia del primer receptor (Catcher) permitiendo detectar múltiples objetivos

Multiples Target de detección

Tecnología TOCE™

11/34

Tecnología TOCE™

12/34

Actividad

Haz clic en el botón para más información y sobre la imagen para ampliarla

13/34

Kit Anyplex II MTB/MDR detection

Nota: No abrir inmediatamente Esperar a que se sedimenten los aerosoles vortex

Extracción de ADNAñadir 200 µl de solución de extracción de ADN a los sedimentos y dar vortex por 30 segundos Cerrar el tubo y calentar durante 10 minutos a 95 C en un bloque de calentamiento

Transferir 1 ml a un tubo nuevo estéril y centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min. Descartar el sobrenadante

Agregar 4% de NaOH en proporción 1:1 Agitar por 1 minuto en vortex

Esputo

14/34

Consideraciones generales para el Pre-tratamiento y extracción de ADN de muestras de esputo

Añadir 1 ml de PBS 1X Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos y descartar el sobrenadante con pipeta

Cortar y macerar una porción de la muestra de tejido en un recipiente estéril .

Tejido Fresco

Extracción de ADNAñadir 200 µl de solución de extracción de ADN a los sedimentos y dar vortex por 30 segundos.Cerrar el tubo y calentar durante 10 minutos a 95 C en un bloque de calentamiento.Se puede realizar extracción automatizada en el equipo STARlet o se puede centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante sirve como eluido (ADN) para la PCR, tomar 5 µl.

Desechar el sobrenadante Agregar 1 ml de PBS 1X y mezclar Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante con pipeta

Sin añadir NaOH al 4%, tomar 1 ml de la muestra, pasar a un tubo Eppendorf y centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos.

Labado Bronquial

15/34

Consideraciones generales para el Pre-tratamiento y extracción de DNA de muestras de lavado bronquial y tejido fresco

Haz clic sobre la imagen para ampliarla

Máximo 5 ciclos de descongelación

Todos los componentes a -20°C

Manejo de Reactivo

Almacenamiento

Incluye el Control Interno Exógeno

16/34

Contenido del Kit Anyplex II MTB/MDR detección (50 Rxn)

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Tejido (Biopsia) Tuberculosis extrapulmonar Esputo Una muestra ideal de esputo debe tener un volumen de 3 ~ 5 ml, primera de la mañanaJugo gástrico NiñosLavado bronquial UCI, sospecha de pacientes paucibacilares Cultivo Solido (Ogawa) y cultivo liquido (MGIT) En el cultivo liquido Cuando se observe una señal positiva de fluorescencia, debe pipetear 1 mL de muestra desde el fondo del tubo.

17/34

Kit Anyplex II MTB/MDR detection | Muestras

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Notas Importantes durante la configuración del termociclador CFX96

Nombrar el Control Silvestre como MWTC como tipo de muestra Desconocido

Configuración de la reacción del Kit Anyplex II MTB/MDR detección (50 Rxn)

18/34

Kit Anyplex II MTB/MDR detection

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Explicación

Informacion de los Target

Análisis de resultados del Kit Anyplex II MTB/MDR

19/34

Kit Anyplex II MTB/MDR detection

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla y sobre el botón para mas información

Visualización de resultados ideales para el control positivo

Análisis de resultados del Kit Anyplex II MTB/MDR en el Seegene Viewer

20/34

Kit Anyplex II MTB/MDR detection

Haz clic sobre la imagen para ampliarla

Identificación de Inconvenientes y posibles soluciones para Kit Anyplex II MTB/MDR

21/34

Kit Anyplex II MTB/MDR detection

Kit Anyplex II - MTB/MDR/XDR Detection

(Núm. Cat. TB7301Y)

Tema 6

22/34

Mutaciones que identifica el Kit MTB/MDR/XDR

23/34

Kit Anyplex II MTB/MDR/XDR detection

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Soluciónlisante

Máximo 5 ciclos de descongelación

Todos los componentes a -20°C

Manejo de Reactivo

Almacenamiento

2TOM

Contenido del Kit Anyplex II MTB/MDR/XDR detección (50 Rxn)

24/34

Lavado bronquialUCI, sospecha de pacientes paucibacilares

Jugo gástricoNiño

EsputoUna muestra ideal de esputo debe tener un volumen de 3 ~ 5 ml, primera de la mañana

Cultivo Solido (Ogawa) y cultivo liquido (MGIT)En el cultivo liquido Cuando se observe una señal positiva de fluorescencia, debe pipetear 1 mL de muestra desde el fondo del tubo.

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Tejido (Biopsia) Tuberculosis extrapulmonar

25/34

Kit Anyplex II MTB/MDR detection | Muestras

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

26/34

Configuración de la reacción del Kit Anyplex II MTB/MDR detección (50 Rxn)

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Para el análisis de datos en Seegene Viewer, establezca los tubos de reacción de MTB/MDR en la columna 1-6 en el bloque y los tubos de reacción de MTB/XDR en la columna 7-12 en el bloque así:

• En los casos de Control tipo silvestre(Wild-type Control), debe escribirse el nombre correcto [MWTC (para la reacción MTB/MDR) o XWTC (para la reacción MTB/XDR)]. Ambos controles se deben identificar como muestras desconocidas

Notas Importantes durante la configuración del termociclador CFX96

Selección de fluoroforos

27/34

Configuración de la reacción del Kit Anyplex II MTB/MDR detección (50 Rxn)

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

Explicación

Informacion de los Target

28/34

Análisis de resultados del Kit Anyplex II MTB/MDR/XDR

Haz clic sobre la imagen para ampliarla

El límite de detección para Anyplex™ II MTB/MDR/XDR Detection es 20 copias/reacción

29/34

Análisis de resultados del Kit Anyplex II MTB/MDR/XDR en el Seegene Viewer

Interpretación de los resultados

30/34

Haz clic sobre cada ícono para ver más información

Interpretación de los resultados Kit Anyplex II MTB/MDR /XDR detection

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla y en cada botón para más información

31/34

Análisis de resultados del Kit Anyplex II MTB/MDR/XDR en el Seegene Viewer

Haz clic sobre cada imagen para ampliarla

32/34

Flujo de trabajo para la detección de MTB mediante los kits se Seegene

Pasa el cursor sobre cada botón para más información

33/34

Matrices validas para TB extrapulmonar y Microbacterias

Haz clic aquí para ver los créditos del curso

¡Creciendo juntos!

¡Excelente trabajo!Has llegado a la parte final de nuestro curso de Tuberculosis, te invitamos a cerrar este contenido desarrollando el test ​ ¡Es hora de poner a prueba tus conocimientos!

4. Referencias Bibliográficas / Info. Experto Temático

3. Aplicaciones de IA - Actividades gamificadas

1. Imágenes y Vectores

2. Videos y Audios

Haz clic en cada signo más "+" para visualizar la información de cada ítem.

Sección de Créditos

3. Buscador de imagenes de GOOGLE. https://images.google.com/

2. Flaticon (Íconos vectoriales y stickers). https://www.flaticon.es/

Sección de Créditos

4. Referencias Bibliográficas / Info. Experto Temático

3. Aplicaciones de IA - Actividades gamificadas

1. Imágenes y Vectores

2. Videos y Audios

1. Freepik (imágenes, vectores, iconos). https://www.freepik.es/

3. Canva (imágenes y videos). https://www.canva.com/

2. Pexels (imágenes y videos). https://www.pexels.com/es-es/

1. Pixabay (videos, música, efectos). https://pixabay.com/es/

Sección de Créditos

4. Referencias Bibliográficas / Info. Experto Temático

3. Aplicaciones de IA - Actividades gamificadas

1. Imágenes y Vectores

2. Videos y Audios

3. elevenlabs (conversor de texto en audio). https://elevenlabs.io/speech-synthesis

2. Educaplay (creación de juegos formativos). https://es.educaplay.com/

1. Narakeet (conversor de texto en audio). https://www.narakeet.com/

Sección de Créditos

4. Referencias Bibliográficas / Info. Experto Temático

3. Aplicaciones de IA - Actividades gamificadas

1. Imágenes y Vectores

2. Videos y Audios

Laura Elise Corzo Prada (Especialista de Producto)Diana Milena Muñoz Forero (Especialista de Producto)

Sección de Créditos

4. Referencias Bibliográficas / Info. Experto Temático

3. Aplicaciones de IA - Actividades gamificadas

1. Imágenes y Vectores

2. Videos y Audios

En la grafica de la derecha podemos ver los resultados correspondientes a la presencia o no del complejo y la resistencia a medicamentos de segunda línea, fluoroquinolonas e inyectables.

La tecnología DPO permite Reducción del ruido de fondo y mejorar la relación señal-ruido durante la amplificación del ADN. Esto es crucial para la detección precisa y específica del objetivo, especialmente en muestras complejas que pueden contener múltiples secuencias de ADN diferentes.

En la grafica de la izquierda podemos ver los resultados correspondientes a la presencia o no del complejo y la resistencia de primera línea.

Test de diagnóstico cualitativo in vitro para la detección simultánea de Mycobacterium tuberculosis y su resistencia a medicamentos antiberculosos de primera línea (isoniazida y rifampicina) Cubre 7 mutaciones que causan resistencia a isoniazida en el gen katG y en la región promotora de inhA, y 18 mutaciones que causan resistencia a la rifampicina en el gen rpoB.

• Catcher: se refiere a oligonucleótidos diseñados específicamente con etiquetas de captura. Estos oligonucleótidos están diseñados para hibridar selectivamente con secuencias específicas de ADN o ARN objetivo. Una vez unidos al objetivo, las etiquetas de captura permiten la detección específica y precisa del patógeno o la variante genética de interés.

• Pitcher: consiste en oligonucleótidos diseñados para amplificar de manera isotermica las secuencias de ADN o ARN previamente capturadas por los "Catchers". La amplificación isotermica significa que el proceso ocurre a una temperatura constante, simplificando el procedimiento y mejorando la eficiencia de la amplificación.

DPO technology - Dual Priming Oligonucleotide: La tecnología DPO (Dual Priming Oligonucleotide) esta compuesto por dos porciones funcionales conectadas por el conector Poly-dI. La longitud de la porción estabilizadora del objetivo del extremo 5' es más larga que la de la porción determinante del objetivo del extremo 3'. El conector Poly-dI forma una estructura similar a una burbuja a una determinada temperatura controla las reacciones de unión de dos pasos necesarios para que la polimerasa extienda un el primer DPO™. La unión inicial se realiza a través de la porción del extremo 5’, luego la región 3’ se une selectivamente al sitio objetivo para realizar una extensión selectiva.