🧪 Práctica 3

Práctica 3 Cinética enzimática

MPSS Kevin Guillermo Viadero Torres

¡Vamos!

Objetivos

Al terminar la práctica el estudiante:

Explicará el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática

Calculará por métodos gráficos la velocidad máxima y la constante de Michaelis de una reacción enzimática.

Conocerá los diferentes tipos de inhibidores enzimáticos que existen y estudiará su efecto sobre la Km y la Vmáx.

Preguntas antes de la práctica

1. ¿Qué es la velocidad de una reacción enzimática?
2. ¿Cómo se define la constante de Michaelis (Km) de una reacción enzimática?
3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (Vmáx) de una reacción enzimática?
4. ¿Para qué le sirve a un médico la determinación de la actividad de algunas enzimas?
5. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación tiene valor diagnóstico?

Introducción

Enzimas

Extraer, transformar y utilizar la energía relacionada con los procesos biológicos.

Son las responsables de degradar y sintetizar las moléculas del organismo

Enzimas

Aceleran la velocidad de las reacciones.

Su actividad solo está limitada por la velocidad con que colisionan con sus sustratos.

La velocidad a la cual transcurre la mayoría de ellas, en ausencia de un catalizador, es extremadamente lenta, incompatible con la vida.

Enzimas

Son reguladas por las concentraciones de sustrato, inhibidores, activadores y reguladores alostéricos.

Las enzimas son altamente específicas por sus sustratos.

Cinética enzimática

Para una enzima que cataliza una reacción irreversible y actúa sobre un único sustrato, se plantea el siguiente modelo

Cinética enzimática

1913 ➡️ Leonor Michaelis y Maud Menten:

Modelo matemático de la cinética de las enzimas no alostéricas (en las que la velocidad de reacción ⬆️ hiperbólicamente conforme ⬆️ la concentración de sustrato).

Cinética enzimática

La ecuación de Michaelis-Menten se puede modificar matemáticamente para obtener su forma lineal (ecuación de Lineweaver-Burk)

Permite determinar de manera sencilla los parámetros cinéticos de una enzima.

Esta ecuación es de utilidad en el análisis de las diferentes formas de inhibición enzimática.

Utilidad médica

Dentro de las ciencias médicas, el estudio de las enzimas tiene utilidad diagnóstica y terapéutica.

Hipótesis

Hipótesis

Si la velocidad de una reacción enzimática depende de la formación de un complejo activo entre la enzima y el sustrato, entonces la velocidad de la reacción variará en función de la concentración del sustrato, alcanzando un valor máximo cuando toda la enzima se sature, es decir, cuando se encuentre en la forma de la máxima formación del complejo enzima-sustrato.

La enzima que sirve de modelo en esta práctica es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.

Actividades

Actividad 1

Para observar el efecto que tienen la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática, es necesario realizar una curva con diferentes concentraciones del sustrato. En la Tabla 1 se encuentra indicado el volumen adicionado de glucosa; en los tubos 5 al 8 la concentración es de 40 mM (solución A) y en los tubos del 1 al 4 es de 4 mM (solución B).

Actividad 1

Tomando en cuenta las concentraciones de las soluciones A y B. Calcule la concentración de glucosa (sustrato) en cada uno de los tubos. Considere que el volumen final en cada tubo es de 4 mL ya que además del agua se adicionó a todos los tubos 3 mL de la solución de enzima.

Actividad 1

1. Graficar los datos obtenidos en la Tabla 2 (considere que el tiempo de incubación de la reacción fue de 20 min).
2. Realizar una gráfica de Lineweaver-Burk con los valores de 1/v Vs 1/[S].
3. A partir del gráfico doble recíproco, calcular el valor de la Vmáx y la Km con y sin inhibidor.
4. Determinar el tipo de inhibición de acuerdo con las gráficas del punto anterior.

Actividad 2

Masculino de 44 años que es encontrado por sus familiares con un cuadro severo de desorientación; el paciente refiere visión borrosa. Como antecedente importante, una noche antes compró una botella de tequila de un expendio cerca de su hogar.

Actividad 2

A la exploración física se encuentra frecuencia cardiaca de 120 lpm, frecuencia respiratoria 30 rpm. Consciente, orientado en persona y desorientado en tiempo y lugar. Fondo de ojo alterado sugerente a pérdida de la visión. Abdomen sin alteraciones y reflejos osteotendinosos normales.

Actividad 2

Diagnósticos:

• Intoxicación por metanol.
• Disminución de la visión secundaria a intoxicación.

Actividad 2

Una de las secuelas más frecuentes de la intoxicación por metanol es la ceguera, la cual se debe a la formación del ácido fórmico.

El ácido fórmico ejerce acción citotóxica sobre los fotoreceptores (conos y bastones).

Comparación del metabolismo del etanol Vs metanol

Actividad 2

El tratamiento para la intoxicación por metanol es la administración de un compuesto que compita con el sitio activo de la enzima encargada de la degradación del metanol.

• Con el uso de etanol ¿cuál es el parámetro cinético que se modificaría?

• Esquematice en una gráfica de doble recíproco la actividad de la enzima en presencia de metanol y etanol.

Actividad 3

A continuación, se presentan dos viñetas clínicas.Con base en el diagnóstico que se proporciona, realice una tabla donde mencione las enzimas de escape que podría encontrar elevadas en sangre en cada caso.

Actividad 3

Actividad 3

Hombre de 45 años que es llevado al servicio de urgencias por sus familiares tras percibir mareo y sudoración excesiva (diaforesis) después de hacer una mudanza; 10 minutos después comenzó con dolor en el pecho del lado izquierdo y dificultad para respirar.

Actividad 2

Antecedentes personales patológicos: tabaquismo positivo desde los 20 años a razón de 6 cigarrillos al día, dislipidemia diagnosticada hace 6 meses sin tratamiento.Exploración física: IMC 35 Kg/m2, FC 120 lpm, FR 25 rpm, TA 160/90 mmHg.

Actividad 2

En la sala de urgencias se le realiza un electrocardiograma que revela un patrón que correlaciona con isquemia en ventrículo derecho. Se inicia protocolo administrándole ácido acetilsalicílico y nitroglicerina, así como el monitoreo continuo de signos vitales y electrocardiograma. Diagnóstico: Síndrome coronario agudo.

Actividad 3

Mujer de 35 años acude a consulta porque hace 2 días inicio con fiebre de 38ºC por la noche, se acompaña de dolor abdominal que se incrementa cuando se recuesta de lado derecho, al caminar y al toser.

Actividad 3

En la exploración física se encuentra dolor a la palpación media en cuadrante superior derecho, se delimita el hígado a 3 cm debajo del borde costal derecho.

Actividad 3

Usted decide realizar un ultrasonidodonde se observa hepatomegalia y una lesión redonda de 10 cm de diámetro de bordes bien delimitados hipoecoica que sugiere absceso hepático. En sangre se encuentran presentes anticuerpos contra E.hystolitica.

Actividad 3

Se inicia tratamiento con metronidazol y se sigue en vigilancia para evitar el drenaje quirúrgico del absceso. Diagnóstico: Absceso hepático amebiano.

Actividad 3

Con respecto al caso 1 ¿Cuál enzima de escape tiene mayor duración en el plasma? Indique el tiempo que permanece elevada

¿Se deben considerar a las enzimas de escape hepáticas como marcadores en el diagnóstico de daño biliar?

¡Recuerda entregar tu práctica!

1/Vmax= 5.87x10^-3 Vmax= 1/5.87x10^-3 Vmax= 202.26 m= Km/Vmax Km= m x Vmax Km= 2.05 x 202.26 Km= 1.18x10^-3

Las concentraciones de CK pueden aumentar en 6 h después del daño; si la alteración no es persistente, los valores son máximos 18 h después de la lesión y regresan a la normalidad en 2 a 3 días. Con daño al miocardio, el valor de la LDH sérica aumenta dentro de las primeras 24 a 48 h tras la aparición del MI, alcanza un máximo en 2 a 3 días y regresa a sus cifras normales en unos 5 a 10 días. Esto hace que la concentración sérica de LDH sea en particular útil para un diagnóstico retrasado de IAM.

Pagana K, Pagana T. Enzimas cardiacas. En: Laboratorio clínico, Indicaciones e interpretación de resultados. 5ª ed. México: Manual Moderno; 2015. Pagana K, Pagana T. Función hepática. En: Laboratorio clínico, Indicaciones e interpretación de resultados. 5ª ed. México: Manual Moderno; 2015.