BIOCHIMICA-Laboratorio analisi

Fatto da Alexandra Nita

BIOCHIMICA

Teoria e Laboratorio Analisi

Immunometria (schema)

IOni, proteine, Immunoglobine e lipidi

indice

Introduzione alla chimica clinica

Chimica Clinica (schema)

Principi di Misurazione

Enzimi e anticorpi

Il sangue è il fluido biologico prelevato più di frequente per le analisi cliniche di laboratorio. Viene in genere prelevato fa una vena (nel braccio) direttamente in una provetta sottovuoto

Le analisi in un laboratorio di chimica clinica consentono di misurare le concentrazioni di ioni biologicamente significativi, piccole molecole organiche e macromolecole

La chimica clinica è la branca della medicina di laboratorio che si occupa principalmente delle molecole.

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INTRODUZIONE

La chimica clinica è una scienza quantitativa che si occupa della misurazione delle quantità di sostanze biologicamente rilevanti presenti nei fluidi corporei.

Calibrazione

PRINCIPI DELLA MISURAZIONE

Controllo Qualità

Fluorescenza

Fotometria

Assorbanza

Potenzionametria

ENZIMI E ANTICORPI

Un enzima è un catalizzatore biochimico, una sostanza che aumenta la velocità di una reazione senza essere consumata nella reazione. Ogni enzima catalizza la conversione di una molecola specifica, definita substrato.

Gli anticorpi (immunoglobuline) vengono create dal sistema immunitario come risposta diretta a sostanzeesterne definite antigeni.

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Elletroliti e Ioni

ANALISI COMUNI

Elletroliti e Ioni

Proteine

Immunoglobine

marker tumorali

Lipidi

converte direttamente il valore in concentrazione dell'analita mediante un software di controllo.

LUCE

COMPUTER (analizza i dati)

FOTOCELLULA

CUVETTA

LUNGHEZZA D'ONDA DELL'ANALITA RICERCATO

MONOCROMATORE

CHIMICA CLINICA- SCHEMA

LUMINOLO

FOSFATASI (Ag-Ab + fosfatasi)

ROTAZIONE

INCUBAZIONE A 37° PER TOT. MINUTI PER LEGARE Ab-Ag

REAGENTE IN MICROSFERE METALLICHE

CAMPIONE

LAVAGGIO CUVETTA

IMMUNOMETRIA- SCHEMA

Gli analiti di interesse in chimica clinica non sono fluorescenti per natura. Vengono invece incorporate delle molecole fluorescenti come reagenti che aiutano a rilevare gli analiti.

La concentrazione del composto fluorescente è direttamente proporzionale alla quantità di luce emessa dal campione

Il rilevatore viene posizionato a un angolo di 90° rispetto alla luce incidente, in modo da rilevare solo la luce emessa e non quella incidente residua che passa direttamente attraverso il campione o quella riflessa dal campione o dalla cuvetta.

Fluorescenza

Alcuni tipi di strutture chimiche sono in grado di assorbire la luce su una lunghezza d'onda e di emettere luce su un'altra lunghezza d'onda. Tali sostanze sono denominate composti fluorescenti.

PROTEINE

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Eletroliti e Ioni

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Gli anticorpi agli antigeni della proteina si possono legare a più siti (o epitopi) sulla molecola della proteina e possono creare cross-link con molte molecole della stessa proteina, fino a formare un composto precipitato insolubile costituito esclusivamente da anticorpi e molecole di antigene. Tale immunoprecipitato si può rilevare con il metodo turbidimetrico

GLI ANTICOPRI E I COMPLESSI IMMUNI

L'esposizione deliberata di un animale a un antigene (immunizzazione) genera anticorpi specifici per l'antigene. Gli antigeni si possono analizzare come le proteine (ad esempio, la transferrina cioè unproteina plasmatica) o i farmaci(l'amikacina). Gli anticorpi prodotti mediante questo tipo di immunizzazioni vengono definiti anticorpi "anti - (nome dell'analita)".

Un complesso immune, complesso antigene-anticorpo o anticorpo legato all'antigene, è una molecola formata dal legame di più antigeni ad anticorpi. L'antigene e l'anticorpo legati agiscono come un oggetto unitario, a tutti gli effetti un antigene proprio con un epitopo specifico.

Il secondo campione di QC viene definito "anomalo" e ha un valore target che non ricade nell'intervallo di riferimento in una direzione ritenuta come clinicamente significativa. Quando ritenuto necessario, il campione di QC anomalo apporterà una concentrazione importante per le decisioni da prendere a livello clinico.

Test controllo qualità(QC)

Nei test di QC con un unico campione, un campione di controllo viene analizzato più volte per un lungo periodo di tempo per verificare la riproducibilità dei risultati del test.I risultati del QC vengono tracciati su un grafico definito di Levey-Jennings. Questi tracciati evidenziano i risultati per le analisi del campione di QC rispetto al valore previsto e all'intervallo dei valori accettabili.Il valore target e l'intervallo di valori vengono determinati dal laboratorio per ogni campione di QC.

Di solito, si monitorano due campioni di QC per ogni test. Uno dei campioni di QC viene definito "normale" e ha un valore target che ricade entro l'intervallo di riferimento previsto per il test specifico.

MARKER TUMORALI

I marker tumorali sono proteine che vengono prodotte selettivamente e rilasciate dalle cellule tumorali, ma in genere non dalle cellule normali. La presenza di queste proteine si può utilizzare ai fini di uno screening, per facilitare una diagnosi, valutare lo stadio della malattia, monitorare l'efficacia della terapia. Non tutti i marker tumorali si possono utilizzare per questi scopi. I marker tumorali in genere vengono misurati utilizzando dosaggi immunometrici e gli intervalli di riferimento sono specifici per il metodo.

Assorbanza

Quando un analita ha un colore intrinseco, la luce visibile viene assorbita quando passa attraverso una soluzione che contiene l'analita (o i prodotti della reazione). L'assorbanza selettiva di determinate lunghezze d'onda dallo spettro della luce bianca attribuisce il colore alla soluzione. Una soluzione che contiene, ad esempio, emoglobina appare rossa perché la luce nella gamma del verde dello spettro viene assorbita in modo selettivo. Se si misura la riduzione della luce verde che si verifica al passaggio attraversola soluzione, è possibile ottenere un'indicazione della quantità di emoglobina presente.

La configurazione utilizzata per misurare la luce assorbita, ovvero la differenza tra la luce emessa dalla fonte luminosa (lo) e la luce che raggiunge il fotorilevatore (ls).

• Il sangue è il campione che si utilizza più spesso per le analisi del laboratorio clinico. Il sangue è costituitoda due parti principali: una porzione liquida (detta plasma, che contiene ioni e molecole disciolte) e una porzione cellulare (globuli rossi, globuli bianchi e piastrine).

• La maggior parte degli analiti di chimica clinica si trovano nel plasma. Parte della preparazione del sangue per la valutazione di tali analiti consiste nella rimozione delle cellule. Questa operazione si esegue mediante centrifugazione del campione, che consente di isolare le cellule sul fondo della provetta del prelievo e rimuovere la porzione liquida da analizzare.

Esse possono essere IgA, IgG (conferisce un'immunità a lungo termine e passa attraverso la placenta per garantire una protezione passivaal feto, dettte anche immunoglobine della memoria), IgM (primi anticorpi ad apparire in risposta ad uno stimolo antigenico) o IgE. Con il termine policlonali si fa riferimento a un aggregato di immunoglobuline monoclonali prodotte da molte linee diverse di cellule T.

Le immunoglobuline sono anticorpi circolanti essenziali per la difesa contro le sostanze estranee. Sono in grado di riconoscere strutture antigieniche specifiche su proteine, virus o batteri, di legarsi a tali strutture e avviare una serie di reazioni finalizzate a disattivare e distruggere l'antigene. Le immunoglobuline vengono suddivise in monoclonali e policlonali. Le immunoglobuline monoclonali vengono prodotte da una singola linea di globuli bianchi (cellule T) e hanno tutte la medesima composizione chimica,sequenza e struttura.

Immunoglobuline

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Eletroliti e Ioni

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Gli elettroliti aiutano a regolare l'equilibrio dell'acqua e l'equilibrio acido-base nel corpo. Le analisi vengono fatte per valutare il bilanciamento complessivo degli elettroliti. Alcune condizioni in cui il bilanciamento degli elettroliti viene alterato sono edema, debolezza, confusione, aritmie cardiache, pressione sanguigna alta, insufficienza cardiaca, patologie epatiche e renali.

Elettroliti e ioni sono piccole particelle elettricamente cariche: i cationi hanno carica positiva e gli anioni hanno carica negativa. Sono rilevabili in tutti i fluidi corporei, sia all'interno delle cellule che nei fluidi extracellulari. Mantengono la pressione osmotica e l'equilibrio tra i fluidi, assumendo un ruolo importante in molti dei processi metabolici.

Eletroliti e Ioni

La misurazione della concentrazione effettiva di uno ione richiede una soluzione diluita all'infinito per eliminare le interazioni tra ioni. La differenza tra la concentrazione misurata in laboratorio e quella in una soluzione idealmente diluita è espressa dal coefficiente di attività, che rimane costante in condizioni specifiche. Tuttavia, variazioni di calore, pH, forza ionica e composizione del campione possono alterare questa relazione.

POTENZIOMETRIA

La potenziometria si basa sulla misurazione di un potenziale elettrico tra due elettrodi. Uno degli elettrodi reagisce al contatto con gli ioni presenti nella soluzione. Il potenziale tra il sensore di misurazione e un elettrodo di riferimento stabile cambia con il variare della concentrazione degli ioni. I metodi potenziometrici sono più indicati per la misurazione degli ioni quali il sodio, il potassio e il cloro.

Per ridurre questi errori, molti analizzatori chimici diluiscono il campione in una soluzione con forza ionica predefinita e eseguono l'analisi in condizioni controllate, un metodo definito "indiretto" perché il campione viene diluito prima della misurazione potenziometrica.

Lo scopo della curva di calibrazione consiste nello stabilire una relazione tra la concentrazione dell'analita e il livello del segnale ottico o potenziometrico registrato dal dispositivo di misurazione. Tale relazione può essere lineare o non lineare (logaritmica o esponenziale).

Calibrazione

La calibrazione è l'importante processo che collega il segnale delle analisi alla concentrazione degli analiti. Si utilizzano una serie di soluzioni che contengono l'analita in concentrazioni note e si osserva il segnale prodotto a ogni livello di concentrazione. I risultati vengono espressi nel formato di una curva di calibrazione.

Il segnale di ogni campione si può confrontare con la curva di calibrazione per determinare la concentrazione di analita che produce tale segnale.

Per la determinazione dell'attività enzimatica è necessario ricorrere alla modalità cinetica. Molti analiti di interesse sono essi stessi enzimi. Per misurare la quantità di un enzima presente, si utilizza un substrato che viene riconosciuto esclusivamente dall'enzima di interesse.

GLI ENZIMI

Gli enzimi sono spesso estremamente selettivi per una, ed esclusivamente una, struttura chimica. La struttura chimica su cui agisce specificamente l'enzima viene definita substrato. Le reazioni enzimatiche si possono utilizzare per la determinazione della concentrazione di un substrato o dell'attività di un enzima.

Per molti analiti nei fluidi biologici, come glucosio, colesterolo, bilirubina o creatinina, la natura ha fornito enzimi che reagiscono in modo selettivo con queste importanti molecole. Gli enzimi si possono utilizzare per catalizzare la conversione di queste molecole (substrati) in reazioni che generano prodotti da osservare fotometricamente

• Se il sangue viene raccolto in una provetta priva di anticoagulante, il sangue formerà un coagulo. Un coagulo è un composto semisolido gelatinoso di proteine legate che si forma in un processo a più fasi che si definisce cascata coagulativa. Durante la centrifugazione, il coagulo scende verso il fondo della provetta insieme alle cellule. Il liquido sovrastante che ne risulta viene chiamato siero.

• Se un campione di sangue viene prelevato in una provetta che contiene un additivo che ne impedisce la coagulazione (definito anticoagulante), la porzione liquida del sangue viene chiamata plasma

Il monocromatore disperde la luce (in modo molto simile a un prisma) e consente di selezionare una fascia di lunghezze d'onda molto stretta da dirigere verso la cuvetta del campione.

Per selezionare la lunghezza d'onda desiderata dallo spetto di luce prodotto dalla fonte luminosa, si utilizza un dispositivo chiamato monocromatore o dei filtri.

Fotometria

Cuvetta: contenitore in materiale trasparente che contiene le soluzioni da sottoporre ad analisi con metodi otticiLa fotometria si fonda sulla misurazione della luce mediante un fotorilevatore.Per ogni analisi vengono selezionate lunghezze d'onda specifiche in base alle proprietà della sostanza soggetta a misurazione.