Técnicas de biología molecular 1.pptx

Técnicas de biología molecular 2

Aislamiento

• La extracción y purificación de ADN obtenido a partir de células de mamífero es requerida para:

Diagnóstico molecular, el análisis forense, la terapia génica, la clonación de genes, la genotipificación, la secuenciación de genes y genomas, la identificación de mutaciones y polimorfismos, el análisis de metilación de ADN y los modelos de animales knock out. El ADN puede ser aislado directamente de tejidos preservados, tejidos vivos sólidos o líquidos, fluidos y cultivos celulares in vitro o líneas celulares.

Fenol es adicionado para separar del ADN los lípidos y las proteínas remanentes el cloroformo es utilizado para facilitar la remoción del fenol .

El ADN puede ser purificado por precipitación con unam ezcla de sales y etanol, y finalmente solubilizado en amortiguador de Tris y 6DOTA .

Las células son disgregadas con detergentes digestión proteica con proteinasa K (nucleasas ) .

Hay diversas casas comerciales como:

• Thermo Scientific®
• Qiagen®
• Promega®
• Sigma Aldrich®
• Roche®
• GE Healthcare Life Sciences®

Manejo previo

Extracción de ADN de tejidos frescos o embebidos en parafina.

• Los especímenes de muestras de tejidos pueden ser almacenados congelados a -80 °C o fijados con formalina y embebidos en parafina (se deben lavar con amortiguadores de fosfatos o solución salina).

mantenerse congelado en nitrógeno líquido y ser pulverizado

polvo debe resuspenderse en 1.2 mL de amortiguador de digestión

X c/ 100 mg de tejido

100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS y 0.1 mg/mL proteinasa K

Manejo previo

Muestras de sangre periférica

• Se deben colectarse en tubos con anticoagulante (EDTA) [centrifugación a 2,000 rpm por 2 min].
• El plasma deberá retirarse y los eritrocitos se eliminan con solución de lisis (NH4Cl, EDTA y KHCO3).
• El paquete celular se lava 5 a 8 veces con la solución de lisis
• A partir de las células sanguíneas puede obtenerse el ADN genómico con el método tradicional de extracción orgánica.
• Los métodos comerciales: DNAzol® BD (Molecular Research Center, Inc), DNeasy® Blood & Tissue Kits (Qiagen) o Maxwell® RSC Blood DNA Kit (Promega).

Tratamiento previo

Extracción de ADN a partir de cultivos celulares in vitro

• Se despegan con tripsina y obtienes el botón (2,500 rpm x 5 min).
• En el caso de células no adherentes, el botón celular se obtiene directamente por centrifugación del cultivo.
• El botón celular se lava 2 veces con amortiguador de fosfatos antes de iniciar la extracción.
• El método tradicional de extracción orgánica o con métodos comerciales.
• Los kits: Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sima-Aldrich), Genomic DNA Extraction PureLink Kit (Thermo Scientifc)

Materiales y equipo

• Fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1)
• Cloroformo Acetato de sodio 0.2 M, pH 5.2
• Amortiguador Tris EDTA (TE) Agua Milli-QTM Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) con las siguientes soluciones: Amortiguador AL - Amortiguador AW1 - Amortiguador AW2 - Amortiguador AE

• 5 mL de sangre periférica en tubo BD vacutainer® con EDTA
• Solución de lisis para eritrocitos PBS
• Etanol absoluto Etanol al 70% (v/v) en agua
• Milli-QTM Proteinasa K (20 mg/mL)
• ARNasa A (100 mg/mL), opcional
• SDS al 10% (p/v)

• Vórtex
• Microtubos de 1.6 mL, nuevos y estériles
• Guantes de látex o nitrilo
• Incubadora a 55°C
• Campana de extracción
• Hielo/contenedor Micropipetas y puntas de 200 μL y 1,000 μL estériles
• Congelador a -20 °C

Proceso

En campana de extracción adicionar 600 μL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y mezclar durante 10 min.

Adicionar 125 μL de SDS al 10% y 10 μL de proteinasa K. 10. Mezclar e incubar a 55 °C durante 1 h.

Centrifugar 2,000 rpm durante 2 min

Eliminar completamente el PBS. Resuspender la pastilla en 1 mL de acetato de sodio 0.2 M pH 5.2

Centrifugar a 3,500 rpm durante 5 min. Recuperar la fase acuosa (superior) en un microtubo

Eliminar el plasma con la ayuda de una micropipeta

Resuspender la pastilla en 3 mL de solución de lisis para eritrocitos y mezclar 5 veces por inversión

Centrifugar a 2,000 rpm durante 2 min y tirar el sobrenadante

hasta que la pastilla esté de color blanco. Resuspender la pastilla en 2 mL de PBS y centrifugar a 1,500 rpm durante 5 min

Repetir 5-8 veces paso 3 y 4

Cuantificar ADN

• Es por medición de la densidad óptica (DO) o absorbancia (A) a 260 nm
• El valor obtenido permite estimar la concentración de ADN o ARN
• Por otra parte, los aminoácidos aromáticos presentes en las proteínas absorben a 280 nm, y también pueden contribuir a la medición total a 260 nm si se encuentran presentes en la solución.
• Para evaluar la pureza por espectrofotometría, se debe medir la absorbancia desde 230 nm hasta 320 nm con el objetivo de detectar otros posibles contaminantes en la solución.

Cálculo de cantidad de ácidos nucleicos

• La concentración del ADN puede ser estimada ajustando la A260 con la medición de turbidez, multiplicándolo por el factor de dilución y la relación A260 de 1.0 = 50 μg/mL de ADN puro:
• Concentración ADN (μg/mL) = (A260-A320) x (factor de dilución) x 50
• ARN se toma una relación de A260 de 1.0 = 40 μg/mL de ARN puro: Concentración ARN (μg/mL) = (A260-A320) x (factor de dilución) x 40

Cuantificación

• Electroforesis en gel.
• La intensidad de la banda del ADN o de las dos bandas de ARN se comparán con la de un estándar que tenga un peso molecular cercano al de la muestra problema.
• De tal forma que si se cargan en el gel 2 μL de la muestra de ADN sin diluir y la banda tiene una intensidad similar a la del estándar de 100 ng, entonces la concentración de ADN en la solución es de 50 ng/μL (100 ng / 2 μL). La misma relación de volumen/concentración se hace cuando se cuantifica ARN.
• Además de determinar la concentración de ácidos nucleicos en la muestra, la electroforesis permite determinar la integridad de los ácidos nucleicos

Responder

• ¿Cuál es el fundamento de la extracción orgánica con fenol?
• 2. ¿Qué papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extracción y purificación convencional con fenol?
• 3. Describa el fundamento de la extracción y purificación de ADN por columnas.
• 4. ¿Qué es la proteinasa K y qué papel juega en la extracción de ADN?
• 5. Menciona 5 líneas celulares de mamíferos

Electroforesis

Separación de ácidos nucleicos por electroforesis horizontal en gel de agarosa

• Movimiento de moléculas cargadas en una solución al aplicar un campo eléctrico.
• Debido a que las moléculas en un campo eléctrico se mueven a una velocidad dependiente de su carga, forma y tamaño.
• La electroforesis de macromoléculas se realiza normalmente aplicando un volumen pequeño de la muestra en una matriz porosa

• En la cámara de electroforesis se coloca entre cámaras con el amortiguador y la conexión eléctrica ente las dos cámaras se realiza a través del gel. Debido a que los ácidos nucleicos tienen carga negativa, los pozos que contienen a las muestras se colocan del lado del electrodo negativo para que estos migren hacia el lado positivo

Velocidad de migración

Factores:

• Tamaño molecular: más grandes migran más lento
• Forma o conformación. El ADN súper-enrollado migra más rápido que el ADN lineal.
• Concentración de agarosa. (< agarosa = poros más grandes y mayor velocidad).
• Amortiguador de electroforesis: En ausencia de iones (agua desionizada) la conductividad eléctrica es mínima y los ácidos nucleicos migran lentamente.

Velocidad de migración

• Fuerza iónica demasiado alta (se generían grandes cantidades de calor, lo que podría fundir el gel y desnaturalizar o degradar los ácidos nucleicos)
• Voltaje aplicado: La velocidad de las moléculas es directamente proporcional al gradiente de voltaje. El intervalo efectivo de separación disminuye al incrementarse el voltaje, por lo que no debe de aplicarse más de 8 V/cm.

Problemas comunes

• Bandas poco definidas: Puede ocurrir cuando la agarosa no gelifica adecuadamente (presencia de burbujas o tiempo de polimerización insuficiente).
• Gel preparado con agua y no con amortiguador
• cargar grandes cantidades de ADN o ARN en el pozo.
• La degradación de los ácidos nucleicos también se observa como un “barrido” a lo largo de todo el carril, debido a la presencia de fragmentos más cortos de diferentes longitudes

• Ausencia de bandas: la muestra salió del gel por corrimiento excesivo o porque los cables fueron colocados incorrectamente
• Bandas tenues: la muestra no ingresa completamente al pozo, o bien si el pozo fue perforado accidentalmente con la punta de la micropipeta al cargar la muestra. También puede deberse a una tinción incorrecta.
• Separación insuficiente de las bandas. Ocurre por corrimiento insuficiente o porcentaje de agarosa incorrecto.

Concentraciones de agarosa

ELECTROFORESIS

DEFINICION: Es un método de separación basado en la diferencia de velocidades de migración de especies cargadas eléctricamente en una disolución amortiguadora a la que se aplica un campo eléctrico constante. Desarrollada por Arne Tiselius para el estudio de proteinas séricas (Nobel 1948). Solamente la electroforesis tiene la resolución necesaria para distinguir polinucleótidos que difieren en 200 y 500 UMAs en secuenciación de ADN.

ELECTROFORESIS

TIPOS: Existen dos tipos principales de electroforesis:

• Electroforesis convencional.
• Electroforesis capilar.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL: Se lleva a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un amortiguador acuoso. Igual que en CCF, se pueden efectuar múltiples separaciones. Las muestras se disponen como manchas o bandas sobre la placa y se aplica un potencial de corriente contínua durante un periodo de tiempo fijo. Las especies separadas se tiñen para visualizarse. Los volúmenes separados son del orden de los μL.

ELECTROFORESIS CAPILAR

NUMERO DE PLATOS EN ELECTROFORESIS CAPILAR: Por existir una única fase en la separación, N sólo depende de la difusión longitudinal, y su expresión viene dada por: donde D es el coeficiente de difusión del soluto en cm2/s. Se usan potenciales elevados para mejorar la eficiencia de separación.

Electroforesis capilar

Ventajas de la electroforesis capilar

• Alta resolución (105 a 106 platos teóricos)-HPCE
• Requiere pequeño volumen de muestra (1-10 nl)
• Rápida separación (1 a 45 min.)
• Aplicable a todo tipo de sustancias
• Automatización
• Cuantificación (lineal)
• Reproducibilidad
• Puede acoplarse a espectrometría de masa
• Datos fundamentales

Esquema de equipo de CE

Tipos de moléculas que pueden ser separadas por CE

• Proteínas
• Péptidos
• Amino ácidos
• Ácidos nucleicos
• Iones inorgánicos
• Bases orgánicas
• Ácidos orgánicos

Condiciones de CE

• Se utilizan altos voltajes 10-30kV.(>500V/cm; 10-20 mA)
• Moléculas positivas, negativas o neutras puede separarse.
• La separación se realiza en un tubo capilar de sílica fundida cubierta con poliamida para darle flexibilidad.
• El tubo capilar tiene 30-100cm. De longitud y 25-100m de diámetro interno.
• Los grupos hidroxilos de la sílica se disocian dejando el tubo con una carga negativa.

ELECTROFORESIS CAPILAR

FLUJO ELECTROOSMÓTICO: Movimiento por el cual el disolvente tamponado migra hacia el ánodo o hacia el cátodo. El movimiento es causado por la doble capa eléctrica que se forma en la interfase sílice/disolución. A pH mayor a 3, la pared interna de un capilar de sílice tiene carga negativa por la ionización de los grupos silanol de la superficie. Los cationes del buffer se agrupan sobre la superficie negativa del capilar para formar la doble capa eléctrica. Los cationes situados en la capa exterior difusa de la doble capa son atraidos hacia el cátodo negativo y como están solvatados, arrastran al resto de la disolución con ellos.

Tubo capilar de sílica con grupos OH expuestos

Flujo electroendosmótico

Migración

Wester Blot

Técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad del Western Blot se logra por el uso de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Se puede usar para indicar si la muestra expresa la proteína de interés o para realizar comparaciones cuantitativas de los niveles de proteína entre diferentes muestras o grupos de tratamiento. Es muy útil para validar la especificidad de un anticuerpo si para inmunohistoquímica, o inmunocitoquímica.

Pasos

1. Preparación de la muestra
2. Electroforesis
3. Transferencia a una membrana
4. Inmunotinción
5. Detección de las bandas

Preparación de la muestra

lisis químicas: se suelen utilizar detergentes. Rompe las membranas celulares y solubilizar las proteínas. ¿cuál usar? Depende en parte de la localización de la proteína de interés dentro de la célula

El detergente se compone de: parte polar y otra no polar. Se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos, no iónicos o zwiteriónicos

Preparación de la muestra

Preparación de la muestra

Con la ruptura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés.

El paso final de la preparación de la muestra es la reducción y la desnaturalización: rompe las estructuras de los niveles superiores de organización para que las proteínas se puedan separar en la electroforesis.

el proceso se realiza en frio (+4°C) con la adición de inhibidores de proteasas al tampón

Esto se hace por tampón que contiene un agente reductor, así como detergente y el calentamiento.

Preparación de la muestra

Para reducir y desnaturalizar las proteínas el tampón de muestra contiene dos agentes: dodecilsulfato de sodio (SDS) y beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT).

El SDS: Agente desnaturalizante que ayuda a descomponer la estructura en aminoácidos, y recubre la proteína con cargas negativas.

Esta relación uniforme de cargas es esencial en el siguiente paso de electroforesis en gel.

El beta-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen sus enlaces sulfuro, y también descomponen la proteína en una estructura lineal de aminoácidos primarios (porque un anticuerpo particular solo reconoce esta forma de la proteína).

Electroforesis

El tipo de electroforesis más usado en Western Blot es el abreviado SDS-PAGE. SDS es el agente desnaturalizante que se agrega al tampón durante este procedimiento. PAGE significa electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles están hechos de acrilamida polimerizada y reticulados por Bis en presencia de persulfato de amonio y TEMED. La estructura del gel puede controlarse con el porcentaje de acrilamida. Al aumentar el porcentaje total de acrilamida, los poros de la matriz del gel se vuelven más estrechos

Electroforesis

Cuando se someten a un campo eléctrico, migran al electrodo positivo.

• Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas, la tasa de migración viene determinada por su peso molecular.
• Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores.
• Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas para asegurar cargar la cantidad correcta de proteínas en el gel: Lowry y Bradford

Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. 20 a 40 µg de proteína total por carril El gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. El tampón utilizado durante la electroforesis contiene: Tris (mantiene el pH) Glicina (conductor electricidad) SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores

Marcadores de peso molecular

Son proteínas purificadas de peso molecular conocido, que se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado.

Control positivo

Control negativo

Control de carga

una proteína común que las muestras deben contener en la misma proporción. De modo que, deberían haber bandas de tamaño similar del objetivo de control

verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta, se carga una muestra de la proteína de interés purificada.

no debe reaccionar ni emitir señal ya que las muestras no contienen la proteína de interés. knockout,.

3. Transferencia

Transferencia de proteínas a otra superficie. Esto se debe a que los geles son un sustrato pobre para la inmunodetección y debido a la fragilidad de los mismo pueden romperse fácilmente. Por lo tanto, se realiza la transferencia la proteína a una membrana más duradera para la posterior inmunotinción. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas, permitiendo así la detección de un anticuerpo.

Tipos de membranas disponibles: PVDF ( fluoruro de polivinilideno), nitrocelulosa o nylon La membrana de PVDF, ofrece una mayor resistencia mecánica, resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventaja de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Si la membrana ha de ser reutilizada diversas veces: Nylon. membranas de PVDF tienen gran capacidad de unión a proteínas y gran resistencia mecánica pero se humedecen con más dificultad. Todas las membranas son hidrofóbicas y requieren un tratamiento previo con metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas.

tinciones

Colorante

Ponceau S, Tinta china o Negro Amido. Ponceau S se emplea en forma de solución acuosa con PBS, se une de manera irreversible

afinidad de la estreptoavidina por la biotina. Los grupos amino primarios y secundarios de las proteínas unidas a la nitrocelulosa se pueden biotinilar. Un lavado posterior elimina el exceso de biotina y después se bloquea la membrana con una solución de leche en polvo. Las proteínas biotiniladas pueden ser detectadas empleando un complejo preformado de estreptoavidina-enzima y el sistema de detección de la actividad enzimática.

Biotina-estreptoavidina:

Tinciones solución de bloqueo

Leche descremada Las soluciones de albúmina sérica bovina (BSA). También se recomienda el bloqueo en Tween-20 si hay demasiado background. Sin embargo es conveniente usar con cuidado los detergentes no iónicos como Tween-20 pues pueden solubilizar las proteínas transferidas a la membrana. En la tabla s

INMUNOTINCIÓN

se usan anticuerpos específicos para que solo se visualice la proteína diana

Existen anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser altamente específicos y más sensibles que los monoclonales. Los anticuerpos monoclonales, a diferencia de los policlonales, mantienen siempre sus propiedades de reconocimiento independientemente del lote. Una vez elegido el anticuerpo a emplear se deben realizar controles en el experimento, como por ejemplo la inclusión de un experimento completo idéntico con sueros pre-inmune (suero negativo), y sin el anticuerpo primario.

Anticuerpos

Se suelen emplear inmunoglobulinas (anticuerpos anti-especie). Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que aisladas de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. La proteína G tiene una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A.

Secundarios / proteína A/ proteína G

1. Bloquear el espacio vacío en la membrana con una proteína neutral. Se incuba con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo ( leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA)).
2. La membrana debe colocarse en un agitador durante 1 hora, o durante la noche a 4 ° C.
3. La membrana se incuba con el anticuerpo primarios monoclonales como policlonales. En general, los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras.
4. periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente o incubación a 4ºC durante toda la noche.
5. Una vez que el anticuerpo se ha unido, la membrana debe lavarse para eliminar cualquier anticuerpo residual. Entre 3-5 lavados con TBST es suficiente durante aproximadamente 10 minutos cada lavado.
6. Después de retirar el anticuerpo primario, la membrana se tratará con el anticuerpo secundario que se conjuga con una molécula que se puede visualizar fácilmente

El anticuerpo secundario será específico para el anticuerpo primario, por lo que se une solo a este y, por lo tanto, se detecta a la proteína de interés. Nuevamente, se debe lavar la membrana 3-5 veces con TBST durante unos 10 minutos es suficiente.