PCR BIOLOGIA

ELENA RODRÍGUEZ HERNÁNDEZ

ANÁLISIS

DE EXPRESIÓN GÉNICA

BIOLOGÍA MOLECULAR. SUBIDA DE NOTA

01

QUE ES LA PCR

02

PCR A TIEMPO REAL

03

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

QUÉ ES LA PCR

DEFINICIÓN

Replica de manera altamente específica un fragmento del material genético millones de veces. Esta técnica sirve para detectar cualquier microorganismo presente en las muestras de los pacientes que han sido infectados, a través de copias, las PCR identifican el ADN y el ARN del agente infeccioso, así como la anomalía celular presente en la muestra analizada. Cómo se lleva a cabo:

• Se extrae una muestra de tejido o fluido corporal.
• Se coloca en un equipo especializado y se le agrega la enzima denominada polimerasa para generar copias.
• En poco tiempo se producen millones de copias en las que si existe algún patógeno o células cancerosas, son detectados por el equipo.

PROCEDIMIENTO DE PCR

QUÉ ES LA PCR

FUNDAMENTO

De manera general, la PCR es una técnica común e indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y pruebas de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Distinguimos varios tipos de PRC:

• PCR anidada.
• PCR de extensión solapada.
• PCR in situ.
• PCR múltiple.
• PCR con transcriptasa inversa.
• PCR a tiempo real
• Entre otras variaciones.

De entre todos ellos, nos centraremos en el último tipo de PCR (a tiempo real).

PCR A TIEMPO REAL

DEFINICIÓN

También denominada PCR cuantitativa, este tipo de PCR combina la amplificación y la detección de la PCR en un solo paso. Eliminando la necesidad de detectar productos mediante electroforesis en gel y, lo que es más importante, permite que el método sea realmente cuantitativo.

APLICACIONES

Sin embargo, de todas las aplicaciones nombradas, nos vamos a centrar en PCR para análisis de alelos y análisis de la expresión génica

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

¿QUÉ ES?

Técnica de Biología Molecular que permite conocer y cuantificar la expresión de los genes en la célula, mediante medición de los ARNm que se encuentran presentes en un determinado momento. Esto permite crear perfiles de expresión de cada célula en determinadas situaciones, ya sea en circunstancias normales de la célula o en momentos en que se ve afectada por alguna enfermedad.

De este modo, se pueden comparar estos perfiles y determinar qué genes están siendo apagados o activados, y así determinar cuál puede ser la causa de esto.

¿EN QUÉ SE BASA?

PROCEDIMIENTO

Esta técnica se basa çen el uso de "tags" de ADNc (pequeños fragmentos de ARNm que han sido transformadas a ADNc). Estos "tags" representan a un ARNm presente en la célula en un momento determinado. De esta manera se puede realizar una secuenciación de estas pequeñas hebras, diferenciando a un ARNm de otro, utilizando las bases de datos de secuencias de ARNm y sabiendo así, la cantidad de ARNm (expresión) que hay y a qué proteína codifica, identificándose su importancia. Así, se permite un análisis rápido de la expresión, conservándose un alto nivel de precisión.

¿PCR Y ANÁLISIS?

La PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) son los tipos de PCR que se utilizan principalmente en la investigación de la expresión génica. Uno de los beneficios de RT-qPCR es que es adecuado para una cuantificación de ARN más sensible y también suele ser una mejor opción cuando se analizan sólo unos pocos genes con una secuencia conocida.

APLICACIONES DE LA PCR PARA EXPRESIÓN GÉNICA. ARTÍCULOS.

ARTÍCULO 3

ARTÍCULO 2

ARTÍCULO 1

ENFERMEDAD LENGUA AZUL

DETECCIÓN DE LA LENGUA AZUL EN OVINOS

CONCEPTOEnfermedad vírica aguda del ganado ovino, caprino y bovino, transmitida por dípteros hematófagos, de presentación estacional y curso febril, caracterizada por lesiones hiperémico-hemorrágicas en mucosa bucal, pezuñas y musculatura, con desarrollo de erosiones y ulceraciones.

EN DIFERENTES SISTEMAS DE PRODUCCIÓN EN PERÚ

Tiene el objetivo de determinar la prevalencia del Virus de la Lengua Azul (VLA) en ovinos, por la técnica reacción en cadena de la polimerasa con Transcripción Reversa (RT- PCR) en tiempo real.

Se evaluaron 366 ovinos de Perú. Para ello:

• Tomaron muestras de sangre de la vena yugular del ovino.
• Se llevó a cabo la extracción y purificación de ARN con el kit QIAmp®
• Después, se realizó la RT- PCR en tiempo real,
• Los resultados de la prueba revelaron dos ovinos positivos a VLA en sistema de crianza extensiva, con las condiciones del ambiente que favorecen el desarrollo del vector Culicoide.

Se concluye que la presencia del VLA en esta región del Perú, hace necesario futuros estudios para determinar la detección de otros serotipos potenciales de VLA en la Amazonia peruana, con la finalidad de mejorar las estrategias de control de la enfermedad.

ENLACE ARTÍCULO

ATRÁS

RT-PCR para análisis de expresión genética

de rendimiento ultraalto y detección de células raras

RT-PCR de un solo paso basada en microgotas que permite el análisis de expresión génica unicelular de rendimiento ultraalto y la detección de poblaciones de células raras con una frecuencia del 0,1%, ofreciendo un método de bajo costo, sensible y adaptable para aplicaciones clínicas y de investigación. PROCEDIMIENTO DE UN ENSAYO: Se analizan tres líneas celulares murinas con diversos perfiles de expresión genética. No se observaron problemas al encapsularlas, lo que indica que nuestro generador de gotas se puede utilizar en una amplia gama de tipos de células. Analizamos las líneas celulares utilizando la plataforma RT-PCR de gotitas y se observaron nuevamente aumentos sustanciales en los productos de amplificación fluorescente en los tres canales después del ciclo térmico

ATRÁS

análisis de PCR

detecta reordenamientos genéticos en muestras de cáncer de pulmón

Mediante técnica de qRT-PCR detecta de forma tumores con reordenamientos de ALK independientemente de la pareja de fusión y también identifica los tumores con la expresión de longitud completa de la expresión del gen que no es detectable por FISH, pero que también puede ser relevante para la terapia de inhibidores de ALK

En el artículo, se menciona una prueba sensible para detectar los reordenamientos y la regulación positiva del gen ALK, que codifica un receptor importante en el desarrollo del cerebro y presente en varios tumores, como el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Se menciona que el gen de fusión EML4-ALK es responsable de un porcentaje de casos de este tipo de cáncer. Además, se destaca la importancia de obtener ARN de calidad a partir de muestras de tejidos fijados en formol y embebidos en parafina para el análisis de expresión génica, y se menciona un nuevo ensayo basado en ARN desarrollado por investigadores en Alemania para detectar reordenamientos de ALK en el cáncer de pulmón de células no pequeñas.

MUCHÍSIMAS GRACIAS

EL PROCEDIMIENTO ES EL SIGUIENTE:

• Se extrae todo el ARNm de una muestra, mediante purificación.

• Gracias a la cola (poli A), se utiliza colas de Timina para la unión de los ARNm al soporte., sintertizando ADNc a partir de los ARNm por medio de una Transcriptasa inversa. Dando mayor estabilidad del ADNc frente al ARNm.

• Se corta el ADNc a partir del soporte de timinas por medio de una enzima de restricción, dejando extremos cohesivos en el sitio de corte.

• En este extremo adhesivo se une un linker, enzima de restricción de tipo II que corta nuevamente el ADNc. Obteniendo un "tag" de ADNc (ARNm), unido a las secuencias que han permitido las hibridaciones.

• Se unen dos "tags" para formar un "ditag". Posteriormente, se procede a amplificar por PCR para obtener una mayor cantidad de ditags y favorecer la secuenciación.

• Los ditags se cortan con la primera enzima de restricción para eliminar los "linkers" y dejarlos con un extremo adhesivo, permitiendo la unión de estos en una gran hebra de ADNc (ditags) o concatenado de ADNc. Éste concatenado se pasa luego a un vector de clonamiento para obtener múltiples copias de éste.

• Por último, se secuencia este y se procede a identificar qué proteína codifican, mediante alguna base de datos. Este último paso puede durar desde semanas hasta incluso meses.