NGS y su aplicación en oncología TFC

TFC de T.S en Anatomía Patológica y Citodiagnóstico

NGS y su aplicación en la oncología

Tutor: Santiago Heble Ochoa

Autor: Ismael Pérez Brotons

14/06/2024

Conclusiones

Introducción y justificación

Bibliografía

Objetivos

Descripción del proyecto

Índice

Marco teórico

Desarrollo del proyecto

Resultados y análisis

JUSTIFICACIÓN

INTRODUCCIÓN

Hablaremos de:- En qué consiste el método, cómo llevarlo a cabo, tipos de ensayos, etc. - La importancia de su aplicación en el ámbito hospitalario (oncología) - Papel del técnico

Contribuye a aumentar la precisión en la elección de tratamientos oncológicos dirigidos

Detecta incluso las mutaciones de mas baja propocion, posibles causantes de recidivas

El periodo de detección y diagnóstico es menor que si lo hicieramos por otros métodos

objetivos

GENERAL

DEMOSTRAR POR QUÉ ES BENEFICIOSA LA APLICACIÓN DEL MÉTODO EN EL ÁMBITO HOSPITALARIO Y SOBRE TODO EN ONCOLOGÍA

ESPECÍFICOS

1. MOSTRAR SU IMPORTANCIA A LA HORA DE ESCOGER UN TRATAMIENTO ONCOLÓGICO DIRIGIDO
2. COMPARAR LOS PRINCIPALES TIPOS DE ENSAYOS QUE EXISTEN DE NGS.
3. EXPONER LAS VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MÉTODOS DE ENRIQUECIMIENTO
4. ENSEÑAR LA FUNCIÓN DEL TÉCNICO EN EL PROCESO

Descripción del proyecto

Marco teórico

Surgimiento de la NGS

La NGS surge debido al gran volumen de estudios de variaciones geneticas relacionadas con patologias y de funionalidad de los genes. Necesitaban secuenciar mas muestras en menor tiempo y era algo que la secuenciacion convencional no podia hacer. Gracias a la NGS podemos secuenciar miles de millones de moleculas de ADN de forma simultanea y paralela. Esto ha permitido que se concluyeran proyectos como el del genoma del neandertal en 2009 Mercado de la NGS: plataformas Illumina e Ion Torrent

Utilidad de la NGS

Secuenciación del genoma completo

Definición:

se estudian las regiones codificantes y no codificantes del genoma humano.

Secuenciación del exoma completo

Definición:

secuenciación dirigida en la que se enriquece del 1 al 2% del genoma humano

Paneles de genes

Definición:

es la secuenciación de un número acotado de genes asociados a la patologia de interés.

Neoplasias

- Se usan los paneles porque cubren zonas en las que se observan mutaciones recurrentes relacionadas con el cáncer- Permiten una alta profundidad de secuenciación, detectando las variaciones de baja frecuencia

Tipos de muestra para NGS

Neoplasias

Tumor hematológico: ADN de médula ósea o de sangre periférica

Tumor sólido: tejido FFPE

Biopsia líquida: plasma

Tener en cuenta

• Evitar muestras con necrosis y calcificaciones
• Punto de corte para NGS> 20% de células tumorales

Desarrollo del proyecto

NGS OCA

NGS OPA

Contiene las variantes impulsoras mas relevantes del cáncer de 50 genes.- se usa sobre todo en microcítico de pulmón

Ensayo de biomarcadores múltiples que cubre 161 genes mas relevantes del cáncer - nos permite detectar mas tipos de tumores que el OPA

Justificación

Flujo de trabajo

Enriquecimiento

Amplificación y secuenciacion masiva paralela

Análisis de los resultados

Preparación de librerias

Preparación de la muestra

Proceso bioinformático

Captura por hibridaciónBasado en PCR (multiplex y emulsión)

FFPE y biopsia líquidaDigestión y extracción

Ion Torrent e Illumina

PReparación de las muestras

EXTRACIÓN ADN FFPE

DESPARAFINACIÓN Y DIGESTIÓN

DESPARAFINACIÓN - CONJUNTO DE ALCOHOLES: xilol y etanol absoluto - SOLUCIÓN DESPARAFINANTE DIGESTIÓN - PROTEINASA K

EXTRACIÓN ADN FFPE

CARGA DE LAS PLACAS PARA EL EXTRACTOR

PLACAS NECESARIAS: 2 REACTIVOS NECESARIOS: DNase Buffer y DNase Nº DE MUESTRAS QUE ACEPTA: 12 en total PLACA 2: se introduce en fila A la mezcla de DNase y DNase buffer. En la fila B hay bolas magnéticas. PLACA 1: se introducen las muestras en la fila A

EXTRACIÓN ADN BIOPSIA LÍQUIDA

CENTRIFUGACIÓN, CONGELACIÓN, DIGESTIÓN

CENTRIFUGACIÓN - PARA SEPARAR EL PLASMA - DEBE VENIR EN UN TUBO CON EDTA A+PARA EVITAR COAGULACIÓN CONGELACIÓN - PARA MANTENERLO HASTA SU USO. DIGESTIÓN - PROTEINASA K Y BUFFER DE LISIS.

EXTRACIÓN ADN BIOPSIA LÍQUIDA

DIGESTIÓN Y CARGA DE PLACAS PARA EXTRACTOR

PLACAS NECESARIAS: 3 Nº DE MUESTRAS QUE ACEPTA: 6 en total REACTIVOS NECESARIOS: ¨Lysys binding solution¨, PBS y proteinasa K PLACA 1: en todos los pocillos tendrá buffer de lisis y ADN PLACA 2 : no se toca, contiene las bolas magnéticas PLACA 3: tendrá buffer de lisis en la fila A de la A1 a la A6

CARGA DEL SECUENCIADOR

COMÚN PARA FFPE Y BIOPSIA LÍQUIDA

PASO 1: debemos traspasar las muestras de la placa del extractor de 48 pocillos a la placa del secuenciador de 96 pocillos PASO 2: debemos preparar las tiras del KIT para introducirlas en el secuenciador.

PReparación de las LIBRERIAS

Objetivo:

Obtener fragmentos cortos de ADN

En qué consiste:

Adición de adaptadores a cada extremo del fragmento a secuenciar. Estos son fragmentos de ADN de doble cadena con secuencias consenso (nucleotidos que aparecen con regularidad) a las cuales se unen los primerspara la amplificación y secuenciación del templado.

ENRIQUECIMIENTO

Objetivo:

Aislar y amplificar los fragmentos de interés para el ensayo antes de secuenciarlos

Enriquecimiento basado en captura por hibridación

Enriquecimiento basado en PCR

PCR multiplex: se amplifican simultaneamente múltiples fragmentos de intéres gracias a la adición de primers especificos para estas secuencias PCR en emulsión:

amplificación y secuenciación

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Análisis bioinformático

Primario

Conversión de la señal obtenida del secuenciador en el chip en millones de secuencias cortas de ADN. (Lecturas)

Secundario

Control de calidad, eliminación o recorte de lecturas de baja calidad, mapeo de cada lectura con la seuencia de referencia, llamado de variantes y alineamiento - Mapeo genera un archivo SAM (sequencing alingment map) que se comprime en BAM (binary alignment map). - Este archivo es leido por el programa IGV (integrative genomic viewer) obteniendo la secuencia, mapeo y alineamiento de cada lectura - Tras varios algoritmos obtenemos el VCF (llamado de variantes) que incluye el genoma de referencia, coordenadas cromosómicas de la mutación, tipo de cambio en la secuencia, valores de calidad etc.

Terciario:

Se hace a partir de VCF y es el filtrado y anotación de las variantes Anotación: se usa la base de datos y nos da el gen, exón, seuencia codificante, aminoácido y proteína a las q afecta la mutacion, info funcional y frecuencia de la mutación Tener en cuenta: cobertura (% de lecturas mapeadas frente a la referencia esperada) y la profundidad del ensayo (cantidad de veces que se secuencia un locus) ya que en neoplasias se necesita una alta profundiad para detectar las variantes de baja frecuencia

Terciario:

Bases de datos mas utilizadas en la anotación

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Enriquecimiento por captura de hibridación

Enriquecimiento por PCR

Papel del técnico de anatomía patológica Ventajas de la aplicación del NGS en clínica para la selección del tratamiento oncológico

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

1. Cantabria. (s.f.). Cantabria es pionera a nivel estatal en aplicar técnicas de secuenciación masiva en todos los casos de cáncer con terapias innovadoras aprobadas. https://www.cantabria.es/web/comunicados/w/cantabria-es-pionera-a-nivel-estatal-en-aplicar-t%C3%A9cnicas-de-secuenciaci%C3%B3n-masiva-en-todos-los-casos-de-c%C3%A1ncer-con-terapias-innovadoras-aprobadas 2. Gaceta Médica. (s.f.). Cataluña, pionera con su nuevo modelo de diagnóstico molecular. https://gacetamedica.com/politica/cataluna-pionera-con-su-nuevo-modelo-de-diagnostico-molecular/ 3. IDISSC. (s.f.). I Jornada Internacional de la Red Oncológica Madrileña (ROM): Redes Oncológicas Europeas. https://www.idissc.org/agenda/i-jornada-internacional-de-la-red-oncologica-madrilena-rom-redes-oncologicas-europeas/ 4. Jauk, F. (2019). Secuenciación masiva paralela (NGS): conceptos básicos y aplicaciones. Hematología, 23, 21-23. 5. Martin, K. (s.f.). PCR Usados en Investigación Genética. https://goldbio.com/articles/article/PCR-usados-Investigacion-Genetica 6. Roche. (s.f.). No hay dos tumores iguales [Infografía]. https://rochepacientes.es/content/dam/roche-pacientes-2/es/assets/pdfs/INFOGRAF%C3%8DA_NO_HAY_DOS_TUMORES_IGUALES_ESP_V4end_M-ES-00007446_(2)%20(2).pdf 7. Roche. (s.f.). Secuenciación masiva. https://rochepacientes.es/cancer/ngs-secuenciacion-masiva.html 8. Rubio, S., Pacheco-Orozco, R. A., Gómez, A. M., Perdomo, S., & García-Robles, R. (2020). Secuenciación de nueva generación (NGS) de ADN: presente y futuro en la práctica clínica. Universitas Medica, 61(2), 161-175. https://revistas.javeriana.edu.co/files-articulos/UMED/61-2%20(2020)/231062391008/ 9. Singh, R. R. (s.f.). Target Enrichment Approaches for Next-Generation Sequencing Applications in Oncology. Diagnostics, 12(7), 1539. https://www.mdpi.com/2075-4418/12/7/1539 10. Thermo Fisher Scientific. (s.f.). Genexus Integrated Sequencer User Guide. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017910_GenexusIntegratedSequencer_UG.pdf 11. Thermo Fisher Scientific. (s.f.). Oncomine Comprehensive Assay. https://www.thermofisher.com/es/es/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development/oncomine-oncology/oncomine-cancer-research-panel-workflow/oncomine-comprehensive-assay.html 12. Thermo Fisher Scientific. (s.f.). Oncomine Precision Assay. https://www.thermofisher.com/es/es/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development/oncomine-oncology/oncomine-precision-assay.html

¡Muchas Gracias!