Tarea P3S2

RETROTRANSCRIPCIÓN

TAREA.P3S2

Diana Sofía Salas Baragán 00477549 Karina Sánchez Ruiz 00505096 María Ileana Suárez González 00499211 Mariana Valery Vega García 00498188 Aline Blancas Corrales 00465865

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Índice

1. Esquema del proceso de retrotranscripción

2. Retrotranscripción para determinar la presencia del RNAm

3. Oligo d(T) para realizar la retrotranscripción

4. ¿Qué es el cDNA?

5. Técnica de PCR en tiempo real para determinar nivel de expresión de un transcrito

6. Ventajas de la qPCR (PCR en tiempo real) sobre la PCR punto final

Proceso de retrotranscripción

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A. Tubo A: RNA total + Oligo d(T) + dNTPs → Incubación a 65°

En el tubo A al incubar a 55° permitimos que el oligo d(T) identifique y se una a la cola poliA del ARNm, es decir se lleva a cabo la fase de alineamiento. Los dNTPs aún no tienen función pues no se encuentra presente la enzima RT-Polimerasa.

B. Tubo B: RT-Polimerasa + Buffer 5x + Inhibidor de RNAsas

En el tubo B no ocurre realmente alguna reacción

• Transcriptasa inversa: No lleva a cabo su función aún pues el ARNm unido al cebador y los dNTPS se encuentran en el tubo A.
• Inhibidor de RNAsas: Servirá para neutralizar posibles RNAasas presentes en la muestra.
• Buffer 5x: Se encarga de mantener las condiciones óptimas para la RT-Polimerasa.

Proceso de retrotranscripción

A y B. Se adiciona el tubo B al tubo A → Incubación a 55°

Al adicionar el tubo B al tubo A e incubar a 55° comienza la retrotranscripción. La Transcriptasa Inversa reconoce al oligo d(T) unido al ARNm y que funciona como primer e inicia la síntesis del ADNc ss al adicionar los dNTPs presentes. El buffer 5x mantiene estable a la enzima y el inhibidor de ARNAasas impide que estas degraden o interfieran con el ARNm.

Retrotranscripción para determinar la presencia del RNAm

La transcripción inversa o retrotranscripción es una técnica utilizada para generar una hebra complementaria de ADN (ADNc) a partir de una molécula de ARNm monocatenario, en la mayoría de los organismo la información genética fluye del ADN a ARN pero la retrotranscripción invierte este flujo basandone en el mecanismo retroviral mediante el cual la enzima transcriptasa inversa puede realizar la retrotranscripción del ARN en ADN. (Martin, s/f) La retrotranscripción del ARN es esencial para la determinación de ARNm por las siguientes razones:

1. Estabilidad: El ARNm es una molécula muy intestable que se degrada con facilidad por se monocatenaria, al convertirlo en ADN complementario mediante la retrotranscripción se obtiene una copia estable que puede ser analizada y almacenada durante más tiempo.
2. Amplificación: La retrotranscripción del ARN a ADNc permite amplificar la señal de ARNm presente en la muestra mediante técnicas como la PCR, lo que facilita su detección y cuantificación.
3. Detección: Ya que la retrotranscripción permite la amplificación de la señal de ARNm al convertirlo en ADNc esto permite amplificar específicamente la secuencia de interés lo que aumenta la sensibilidad y la especificidad.
4. DNA pol: La DNA polimerasa utilizada en la amplificación de una PCR NO reconoce los uracilos presentes en el RNA, al retrotranscribir se sustituyen por timinas que son reconocidas por la DNApol.

(Cariaga & Darío, 2007)

Objetivo del Oligo d(T) en la retrotranscripción

Los oligo d(T) (oligonucleótidos que consisten en una secuencia de bases de timina, T) durante la retrotranscripción se utiliza para iniciar la síntesis de ADNc (ADN complementario) a partir del ARNm presente en una muestra. (Oligo DT primers | Biocomapre, s.f)

El objetivo de agregar oligo d(T) es proporcionar un punto de anclaje específico para la retrotranscriptasa, la enzima responsable de sintetizar el ADNc. Esto es posible pues el oligo d(T) se une selectivamente a la cola de poli-A, la cual está presente en la mayoría de los ARNm de células eucariotas, y esta cola de poli-A es una característica del extremo 3' y proporciona un sitio específico de inicio para la síntesis del ADNc. (Oligo DT Primers | Biocompare, s. f.)

¿Qué es el cDNA?

El ADNc (ADN copia o ADN complementario) es una molécula de ADN sintético que se transcribió a partir de un ARNm específico que funciona como "plantilla" mediante una reacción llamada retrotranscripción donde se utiliza la enzima transcriptasa inversa para la conversión. (National Human Researh Institute, 2024) Mientras que el ADN contiene intrones (secuencias no codificantes) y exones (secuencias codificantes), el ADNc sólo contiene las secuencias codificantes pues se origina a partir del ARNm maduro al que ya se le han eliminado los intrones pues su objetivo es llevar las instrucciones para la síntesis de proteínas. (National Human Research Institute, 2024)

El ADNc se suele utilizar para estudiar la expresión génica, identificar genes nuevos y desconocidos, clonar genes para producir proteínas específicas y otros experimentos de investigación. (National Human Research Institute, 2024)

qPCR para determinar nivel de expresión

La qPCR es un método que permite identificar y cuantificar secuencias específicas, además de cuantificar los niveles de expresión génica de un transcrito en una muestra. (Promega, s/f) Se basa en la amplificación y detección simultánea del ADN diana durante la PCR gracias al uso un agente intercalante como el Sybr Green que se intercala entre las bases del ADN bicatenario (doble hebra) y que al ser excitado con luz UV emite fluorescencia. (Herrero, 2023)

La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra, la cantidad de fluorescencia aumenta exponencialmente durante cada ciclo de amplificación de PCR pues aumenta la cantidad de ADN, al graficar la fluorescencia en función del número de ciclos de PCR se obtiene una curva de amplificación que está relacionada con la cantidad inicial de ADN presente en la muestra. (Neidler & León, 2017)

qPCR para determinar nivel de expresión

Para cuantificar el nivel de expresión de un transcrito la qPCR se adapta para amplificar ARN mediante la retrotranscripción (RT-qPCR) donde el ARN se convierte en ADNc.Extracción de ARN: Se extrae el ARN total de la muestra de interés que contiene los transcritos de los genes que se desean estudiar. Retrotranscripción (RT): El ARNm se convierte en ADN complementario mediante el siguiente proceso:

• Enzima transcriptasa inversa convierte el ARN → ADNc ss (single stranded).
• Se degrada el ARN con una ARNasa.
• DNA pol sintetiza la segunda cadena de ADN (ADNc ss → ADNc ds (double stranded))

PCR cuantitativa (qPCR): Se realiza la amplificación de ADNc mediante qPCR donde se añade tinte fluorescente que se une al ADN de doble hebra (a medida que aumenta el ADNc también aumenta la fluorescencia emitida). Cuantificación: La cuantificación se realiza mediante el umbral de ciclo (Ct) que representa el número de ciclos de PCR necesarios para que la fluorescencia alcance el umbral, cuanto mayor sea la cantidad inicial de ADNc más rápido alcanzo el Ct. La cantidad de ADN inicial se determina comparando los datos de fluoresencia con los de un estándar conocido.

(Diseño experimental y Análisis de datos en la técnica qRT-PCR, 2019)

Ventajas de la qPCR sobre la PCR punto final

PCR punto final

qPCR

Amplificación y detección de productos en 2 etapas separadas.

Rango dinámico de detección estrecho

Detección durante la fase exponencial.

Menor sensibilidad

Menor especificidad.

Requerimiento de equipamiento y reactivos de bajocosto.

Amplificación y detección de productos en un misma etapa

Rango dinámico de detección amplio

Detección durante la fase exponencial temprana (máxima eficiencia de reacción).

Mayor sensibilidad

Mayor especificidad con el uso de sondas.

Requerimiento de equipamiento y reactivos muy costosos.

Vs.

Turmero, P. (2015, diciembre 9). PCR en tiempo real. Monografias.com.

Bibliografía

1. Martin, K. (s/f). Revisión y Aplicaciones de la Transcriptasa Inversa y ADNc. Goldbio.com. Recuperado el 13 de abril de 2024, de https://goldbio.com/articles/article/Revision-Aplicaciones-de-Transcriptasa-Inversa-ADNc
2. Cariaga, A., & Darío, P. (2007). EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. Edu.ar. https://editorial.unam.edu.ar/images/documentos_digitales/El_laboratorio_de_biologia_molecular-Ariel_Ernesto_Cariaga_Martinez__Pedro_Dario_Zapata.pdf
3. Oligo DT Primers | Biocompare. (s. f.). https://www.biocompare.com/pfu/121624/soids/2313944/Primers_and_Probes/Oligo_dT_Primers
4. National Human Genome Research Institute. (2024, abril 9). ADNc (ADN copia). Genome.gov. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/ADN-copia
5. Promega. (s/f). PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y RT-qPCR. Promega.com. Recuperado el 13 de abril de 2024, de https://worldwide.promega.com/es-es/products/pcr/qpcr-and-rt-qpcr/
6. Herrero, A. (2023, noviembre 30). INTRODUCCIÓN A LA TÉCNICA DE qPCR. Labbox España. https://esp.labbox.com/tecnica-qpcr/
7. Neidler, S., & León, I. (2017). ¿Cuales son las diferencias entre PCR, RT PCR, qPCR y RT qPCR? AllScience. https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/cuales-son-las-diferencias-entre-pcr-rt-pcr-qpcr-y-rt-qpcr
8. DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANÁLISIS DE DATOS EN LA TÉCNICA DE LA qRTPCR. (2019). Ucm.es. https://www.ucm.es/data/cont/docs/261-2019-03-22-pr%C3%A1ctica%204_DISE%C3%91O%20EXPERIMENTAL%20Y%20AN%C3%81LISIS%20DE%20DATOS%20EN%20LA%20T%C3%89CNICA%20DE%20LA%20RT%20qPCR%20(1).pdf
9. Turmero, P. (2015, diciembre 9). PCR en tiempo real. Monografias.com.