TRABAJO ELECTROFORESIS

LA ELECTROFORESIS

ÍNDICE

Profesora: Francisca García

CFGS Anatomía Patológica y Citodiagnóstico

Realizado por: Natalia Rojas y Ana Mª Rojas

1.- INTRODUCCIÓN

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se usa una corriente eléctrica para moverlas a través de un soporte, provocando que las moléculas más pequeñas se desplacen más rápido recorriendo una mayor distancia que las moléculas grandes que migran lentamente y recorren una distancia más corta. Es una técnica diversa que se usa en medicina forense o en técnicas de biología molecular, como para visualizar los resultados de la PCR.

2.- EQUIPO BÁSICO DE ELECTROFORESIS

3.- PREPARACIÓN Y USO DEL EQUIPO

PREPARACIÓN

USO DEL EQUIPO

• PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

• PASOS DE LA ELECTROFORESIS

• PREPARACIÓN DEL SOPORTE

• PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN TAMPÓN

4.- FACTORES QUE AFECTAN A LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN

SOPORTE

TAMPÓN

FORMA Y TAMAÑO DE LAS PARTÍCULAS

CAMPO ELÉCTRICO

TIEMPO

5.- PRINCIPALES TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS

5.1.- Electroforesis en Cellogel

5.2.- Electroforesis en gel de agarosa

5.3.- Electroenfoque (EEF)

5.4.- Electroforesis bidimensional

5.5.- Electroforesis en campos pulsantes (PFGE)

5.6.- Inmunoelectroforesis

5.7.- Electroforesis capilar

5.1.- ELECTROFORESIS EN CELLOGEL

INTRODUCCIÓN

PREPARACIÓN

PROCEDIMIENTO

REVELADO

LECTURA

5.2.- ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

INTRODUCCIÓN

PREPARACIÓN

PROCEDIMIENTO

REVELADO

LECTURA

5.3.- ELECTROENFOQUE

INTRODUCCIÓN

PREPARACIÓN

5.4.- ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

INTRODUCCIÓN

PREPARACIÓN

PROCEDIMIENTO

REVELADO Y LECTURA

5.5.- ELECTROFORESIS EN CAMPOS PULSANTES (PFGE)

INTRODUCCIÓN

EQUIPO

PREPARACIÓN

PROCEDIMIENTO

TIPOS

5.6.- INMUNOELECTROFORESIS

INTRODUCCIÓN

PREPARACIÓN

PROCEDIMIENTO

REVELADO Y LECTURA

5.7.- ELECTROFORESIS CAPILAR

INTRODUCCIÓN

EQUIPO

APLICACIONES

PROCEDIMIENTO

LECTURA

6.- BIBLIOGRAFÍA

• https://kalstein.com.mx/como-funciona-un-equipo-de-electroforesis/

• https://kalstein.ec/es-importante-una-fuente-de-alimentacion-para-una-camara-de-electroforesis/

• https://es.slideshare.net/eugenia.grisolia/electroforesis-238671338

• https://www.bioted.es/protocolos/ELECTROFORESIS-BASICA.pdf

• https://innovaciondocente.unizar.es/convocatorias2011/documentos/184Electroforesis%20proteinas%20presentacion%20pp%20[Modo%20de%20compatibilidad].pdf

• https://www.studocu.com/es/document/universidad-autonoma-de-madrid/bioquimica/soluciones-electroforesis-introduccion/57794299

• https://slideplayer.es/slide/5403518/

• https://www.salud.mapfre.es/pruebas-diagnosticas/laboratorio/proteinograma/

• https://prezi.com/p/srjjthucehmp/electroforesis-cellogel/

• https://espaciodecesar.com/2007/12/08/electroforesis-en-acetato-de-celulosa/

• https://www.quimica.es/enciclopedia/Isoelectroenfoque.html

• https://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

• https://www.uco.es/investigacion/portal/images/documentos/scai/equipamiento_proteomica/ELECTROFORESIS_BIDIMENSIONAL.pdf

• https://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

• https://www.bioted.es/wp-content/uploads/2023/11/272-EDV190516.pdf

• http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-content/uploads/2017/03/Electroforesis.pdf

• https://www.genome.gov/es/genetics-

• glossary/Electroforesis#:~:text=La%20electroforesis%20es%20una%20t%C3%A9cnica,gel%20o%20de%20otra%20matriz

LECTURA

Los resultados se observan en porcentaje de cada fracción respecto a la concentración. El informe se puede obtener por:

• Espectrofotometría: introducir las franjas recortadas en distintos tubos con un disolvente que extrae las proteínas del Cellogel y agitarlas hasta que se disuelvan, obteniendo una disolución de cada franja. Se mide la absorbancia de cada tubo y se comparan con el total de las proteínas.

• Densitometría: con un fotómetro se cuantifica el colorante en cada franja para obtener un proteinograma con las fracciones de cada proteína respecto al total.

Muestra: suero obtenido por la centrifugación de una muestra de sangre. Soporte: tiras de acetato de celulosa. Es más sencillo utilizar las tiras comerciales Cellogel. Previo a su uso, deben sumergirse 10 minutos en el tampón y secarse entre dos láminas de papel de filtro. Reactivos:

• Tampón: mantiene las proteínas con carga negativa. Ej: TRIS
• Colorante: permite visualizar las bandas separadas. Ej: negro amido en ácido acético, azul de Coomasie en metanol, rojo Ponceau en ácido tricloracético, etc.
• Solución decolorante: metanol a concentración menor (45%) y ácido acético (10%).
• Solución transparentizadora: metanol a concentración mayor (85%) y acético (15%).

PREPARACIÓN

ELECTROFORESIS CAPILAR

PURIFICACIÓN PREVIA

• Se purifica el ADN a separar para que se mantenga íntegro. La purificación convencional no es adecuada porque las moléculas de ADN se fragmentan, de forma que la solución aplicada consiste en mezclar las células de la muestra con agarosa caliente y verterlo en moldes de para que solidifique y forme insertos. En éstos se encuentran las células intactas a las que se les realiza una lisis celular y digestión de las proteínas sin alterar las moléculas grandes de ADN.
• Se eliminan los restos de la digestión para obtener un bloque de agarosa sólo con el ADN intacto y se deposita en un pocillo del gel de electroforesis.

También puede cargarse el ADN en el gel como una disolución de alta viscosidad con agarosa fundida. El medio a usar depende de la naturaleza de la muestra y tamaño del ADN.

PREPARACIÓN

El gradiente se obtiene añadiendo compuestos anfóteros (proteínas) de bajo peso molecular al preparar el gel de poliacrilamida, de modo que al aplicar una diferencia de potencial al gel ya preparado, cada anfótero presente migra hacia el polo que le corresponda buscando su pI.

ÍNDICE

1.- INTRODUCCIÓN 2.- EQUIPO BÁSICO- Fuente de alimentación - Cubeta - Soporte 3.- PREPARACIÓN Y USO DEL EQUIPO 4.- FACTORES QUE AFECTAN A LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN 5.- PRINCIPALES TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS 5.1.- Electroforesis en Cellogel 5.2.- Electroforesis en gel de agarosa 5.3.- Electroenfoque 5.4.- Electroforesis bidimensional 5.5.- Electroforesis en campos pulsantes 5.6.- Inmunoelectroforesis 5.7.- Electroforesis capilar 6.- BIBLIOGRAFÍA

CABLES DE ALIMENTACIÓN

Conectan la fuente de alimentación con los electrodos de la cubeta de electroforesis para conducir la electricidad. El cable negro corresponde al polo negativo y el cable rojo al polo positivo. Las moléculas negativas se desplazan al polo positivo (ánodo) y las positivas se desplazan al polo negativo (cátodo).

REVELADO Y LECTURA

FORMA Y TAMAÑO DE LAS PARTÍCULAS

Las partículas de menor tamaño, al tener menor superficie de fricción, se van a desplazar más rápido y a mayor distancia, mientras que las partículas de gran tamaño se van a desplazar más lentamente y a menor distancia. De igual forma, las moléculas de estructura esférica tienen menos superficie a igualdad de volumen, por lo que migran más rápido.

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

INTRODUCCIÓN

La electroforesis capilar es la técnica que utiliza campos eléctricos de alto voltaje para separar los componentes de una disolución dentro de un capilar muy fino de sílice fundida. Junto a la disolución está el tampón que conduce la corriente y es entre los extremos del capilar donde se aplica una diferencia de potencial con el alto voltaje para separar las moléculas.

PREPARACIÓN

Muestra: se extrae el ADN nuclear y se amplifica por PCR. Después, se prepara una disolución con la muestra y tampón que se usarán en la electroforesis junto a la sacarosa, glicerol o Ficoll para aumentar la densidad y facilitar la siembra. Gel: debe tener un grosor adecuado (3-4 mm de grosor y 15-20 cm de largo):

• Hidratar la agarosa con el tampón por 10 minutos. Bullir esa solución y enfriar hasta 55ºC. Verterla en un molde para que se solidifique y forme un gel.
• Formar los pocillos de siembra con un peine.

Solución tampón: debe mantener el pH sobre 8 (TBE o TAE). Suelen añadirse algunos marcadores electroforéticos.Sustancia reveladora: usar un agente intercalante (BrEt) que se intercala entre las bases nitrogenadas del ADN y emite fluorescencia cuando se ilumina con luz UV. Se puede usar en el revelado o en la preparación del gel.Marcadores de peso molecular: con ADN de tamaño conocido para usar como patrones electroforéticos de control.

INMUNOELECTROFORESIS

Es una técnica compleja que se emplea para medir el pI de cada proteína en la muestra gracias a que se conoce la geometría del gradiente de pH en el gel.

Las proteínas que inician en las regiones de pH inferior a su pI tienen carga positiva, por lo que migran en dirección alcalina (cátodo). De igual forma, las que se encuentren en un pH superior a su pI poseen carga negativa y se desplazan hacia la región ácida (ánodo). En ambos casos, la migración dirige las proteínas hacia la zona donde el pH coincida con su pI, haciendo que su carga sea neutra y por tanto su desplazamiento a lo largo del soporte se detenga, pudiendo visualizar bandas estrechas donde coinciden el pI y pH.

REVELADO Y LECTURA

El revelado se realiza con una tinción de azul Coomassie, porque se fija a las proteínas, pero no al soporte. Así mismo, también se usan con frecuencia la tinción fluorescente con Sypro Ruby y la tinción con plata. Esta última permite aumentar el límite de sensibilidad del azul de Coomassie unas 50 veces.

Para la lectura de los resultados se emplean instrumentos de adquisición de imágenes como los escáneres de fluorescencia. Una vez obtenida la imagen, ésta se digitalizará y se procederá a la interpretación de los resultados.

ELECTROENFOQUE / ISOELECTROENFOQUE

SOLUCIÓN TAMPÓN

Evita que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más básico, por lo que reduce el efecto de electrólisis por acción del campo eléctrico sin afectar a las moléculas a separar.Debe tener una fuerza iónica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso de la electroforesis. Se diferencian:

• Continuos: Se emplea un único tampón.
• Discontinuos: Se emplean mínimo dos tampones con pH y composición diferentes.

APLICACIONES

Permite la detección y cuantificación de moléculas orgánicas e inorgánicas, por lo que se emplea en distintos ámbitos:

• Biomédico: proteínas, drogas de abuso, análisis forense, marcadores tumorales...
• Farmacéutico: control de calidad de preparados farmacéuticos, fármacos de quimioterapia y de estructura quiral...
• Alimentario: aminoácidos, azúcares, aditivos, contaminantes…
• Control ambiental: identificación de contaminantes y de sus metabolitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos.

PASOS DE LA ELECTROFORESIS

Tras preparar todos los componentes necesarios:

• Colocar el soporte en la cubeta de electroforesis.
• Colocar las muestras en la zona de siembra (si la muestra tiene carga - se coloca en el cátodo para que migre al ánodo y viceversa). La forma de siembra depende del tipo de soporte (lo más común son los pocillos).
• Seleccionar el tiempo y voltaje que corresponda siguiendo las instrucciones de la fuente de alimentación. Las moléculas comenzarán a migrar formando una serie de bandas. Cada una se corresponde con una sustancia distinta, si están lo suficientemente separadas se obtiene una buena resolución.

• Realizar un revelado (marcar las bandas del soporte con colorante y después lavarlas de forma general).
• Realizar la lectura e interpretación de los datos obtenidos según el tipo de técnica empleada.

MEDIO DE SOPORTE

Matriz sobre la que se deposita la muestra a separar. Se coloca en el puente de la cubeta de electroforesis con sus extremos en contacto con el tampón en los dos recipientes de ésta. El soporte debe ser inerte para no alterar el desplazamiento de las moléculas. Se distinguen 2 tipos:

• No restrictivos: moléculas de la mezcla con tamaño menor que el del poro del soporte. Se separan según su carga eléctrica. Ej: acetato de celulosa, agar o papel.
• Restrictivos: moléculas se separan según su carga y tamaño (soporte tiene un tamaño de poro que le permite actuar como un tamiz). Destacan:
• El Gel de Agarosa: para separar fragmentos de mayor tamaño, como proteínas y ácidos nucleicos. Electroforesis más rápida pero resolución limitada. Su tamaño de poro depende de cuánta agarosa tenga, pero en general tiene una alta porosidad.
• El Gel de Poliacrilamida (PAGE): matriz con tamaño de poro que depende de la composición del gel, siempre menor al de agarosa. Para separar moléculas de pequeño tamaño. Electroforesis más lenta con mayor poder de resolución.
• El Gel de Almidón: sustituido por el gel de poliacrilamida.

EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR

Su equipo es distinto al básico y consiste en:

• Capilar de sílice fundida

• Sistema de refrigeración del capilar
• Fuente de alimentación de alto voltaje
• Viales con el electrolito y la muestra
• Dos electrodos de platino
• Detector
• Sistema de registro y análisis de señal

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN TAMPÓN

En caso de no usar un tampón comercial desde el principio, se prepara el tampón en el que se va a sumergir el soporte con la concentración adecuada. Por ejemplo, se puede diluir la solución comercial con agua destilada para obtener un tampón de menor concentración.

TIEMPO

Se combina con el voltaje y el tamaño del soporte. A mayor tiempo, mayor distancia de separación entre las moléculas cuya velocidad de migración son distintas.

El equipo de electroforesis que se utiliza es distinto al básico, presentando cambios en la fuente de alimentación y la cubeta de electroforesis. La cubeta, posee un conjunto de electrodos y no sólo un par, con un diseño y disposición que permiten aplicar las distintas orientaciones del campo eléctrico. También tiene un sistema de recircularización del tampón a una temperatura muy controlada para evitar cualquier mínima variación en la temperatura del gel.

EQUIPO

En número de electrodos varía según el tipo de electroforesis en campo pulsante

PROCEDIMIENTO

1º Realizar un isoelectroenfoque: separando las proteínas en base a su pI en gradientes de pH inmovilizados, de manera en la que las proteínas presentes en regiones cuyo pH sea inferior a su pI, cargadas positivamente, migrarán hacia el cátodo y viceversa.

2º Realizar una separación según el PM con PAGE-SDS: este detergente se une firmemente a las proteínas haciéndolas asumir una estructura desordenada que permite obtener una desnaturalización eficiente para separar las proteínas según sus masas moleculares por los efectos de filtración por geles.

LECTURA

Introducir el gel en el transiluminador con luz UV, provocando la fluorescencia del BrEt. El transiluminador presenta una cámara fotográfica que toma una imagen del gel irradiado con sus bandas.

A partir de un procesador de imágenes digitales se puede estimar la concentración de ADN, reconociendo el tamaño de las moléculas al compararlas con los controles de PM.

TIPOS

Existen distintos tipos pero el más utilizado es el campo eléctrico homogéneo con pinza (CHEF), con una disposición hexagonal de 24 electrodos. Otros tipos son:

• Electroforesis en gel de inversión de campo (FIG)
• Electroforesis en gel de campo alterno ortogonal (OFAGE)
• Electroforesis en gel de inversión de campo asimétrica (AFIGE)
• Electrodos programables de control autónomo (PACE)
• Electroforesis en gel rotatorio (RGE)
• Electroforesis en gel de campo ortogonal homogéneo pulsado (PHOGE)

ELECTROFORESIS EN CELLOGEL

PROCEDIMIENTO

• 1º Sembrar una mínima cantidad de muestra en el extremo catódico de la tira sin llegar al borde. Existen distintos aplicadores según el volumen que se va a sembrar. Además, conviene hacerlo rápido para evitar la evaporación del líquido del acetato y que se reseque.

• 2º Introducir el puente y verter el tampón en los recipientes de la cubeta de electroforesis, de forma que lalos extremos de la tira de Cellogel y el tampón entren en contacto.
• 3º Tapar y poner en funcionamiento la fuente de alimentación a una intensidad y tiempo adecuados.

Es una técnica que se caracteriza en aplicar cambios periódicos en el campo eléctrico para inducir la reorientación de fragmentos de ADN con un tamaño grande, haciendo que estos se separen. Se realiza cuando el fragmento de ADN es muy grande (no puede separarse con electroforesis convencionl). Se aplica en microbiología para detectar agentes patógenos bacterianos aislados en muestras clínicas, como la sangre u orina.

Se utiliza un gel de agarosa al 1% pero se altera periódicamente la orientación del campo eléctrico, activando un conjunto de electrodos. El constante cambio de dirección provoca el desprendimiento de las moléculas para que avancen a través de los poros, extendiéndose.

INTRODUCCIÓN

Procedimiento que se basa en separar e identificar proteínas en función de su comportamiento electroforético y a sus propiedades inmunológicas, combinando la electroforesis en gel de agarosa y la inmunodifusión.

Esta técnica se caracteriza por la gran especificidad y sensibilidad que presenta, permitiendo diferenciar sustancias con movilidades electroforéticas idénticas y detectar componentes a concentraciones mínimas.

La electroforesis en Cellogel es aquella que se realiza en un gel de acetato de celulosa y se emplea en bioquímica principalmente para el proteinograma, una técnica de separación de las proteínas presentes en un suero para el análisis semicuantitativo de su presencia en el plasma sanguíneo.

Permite detectar un exceso o déficit proteico y el diagnóstico de procesos inflamatorios, cirrosis hepática, nefropatías o defectos inmunológicos. Las proteínas que principalmente se separan son las albúminas y globulinas. El proteinograma también puede realizarse en electroforesis con gel de agarosa o en electroforesis capilar.

PROCEDIMIENTO

Tras la electroforesis en gel de agarosa, se realiza la inmunodifusión:

• Con un bisturí realizar un canal en el gel paralelamente a la dirección de migración (en caso de no haber utilizado el formador de canales).
• Depositar los anticuerpos específicos frente a las proteínas que estamos buscando, ya separadas por la electroforesis.
• Mantener los geles a temperatura ambiente por 24-48 horas.
• Si se produce la reacción, se formarán complejos insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales.

MEDIO DE SOPORTE

• Adsorción: provoca la retención de las moléculas en el soporte, dificultando su desplazamiento y por tanto afectando a la velocidad.

• Electroendosmosis: Provocada en soportes no restrictivos debido a la aparición de cargas que provocan que la propia solución migre hacia el campo eléctrico correspondiente (produce cargas negativas y positivas que se desplazan sobre el soporte interfiriendo en la migración de las partículas)

• Tamizado molecular: si las partículas presentan un tamaño aproximado al poro tendrán mayor dificultad de migrar con respecto a las que tengan un tamaño inferior. Los poros del soporte son capaces de separar las moléculas en función de su tamaño.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE SOPORTE

Se prepara el gel o matriz que vayamos a utilizar como soporte para poner la muestra a valorar. En este paso hay que tener en cuenta que el soporte tenga el grosor, la textura y composición adecuados según el tipo de electroforesis y el producto a separar.

Papel

Gel de agarosa

Gel de poliacrilamida

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Se prepara la muestra procurando que se encuentre la sustancia o sustancias que queremos analizar muy concentradas, por lo que se realizan otro tipo de técnicas necesarias para conseguirlo, como la centrifugación.

ELECTROFORESIS EN CAMPOS PULSANTES

Gradiente de potencial que hace posible la técnica. cargadas. Los factores del campo eléctrico que influyen son:

• Diferencia de potencial: medida en V, define el campo eléctrico. A mayor potencial, mayor será la velocidad de migración.
• Intensidad de corriente: medida en Amperios, cuantifica el flujo de la carga eléctrica.
• Resistencia: medida en Ohmios. A mayor resistencia, menor velocidad de migración.
• Efecto Joule: este efecto produce calor al pasar una corriente eléctrica, por lo que debe controlarse para que no provoque la desnaturalización de la muestra y que así no impida la separación de las partículas. Las electroforesis de alto voltaje deben tener un sistema de refrigeración.

CAMPO ELÉCTRICO

REVELADO

2º Aclarar la tira recién teñida lavándola y agitando en el decolorante unas 3-4 veces hasta observar fondo blanco. Se pasa por una solución transparentizadora y se coloca entre 2 hojas de papel de filtro para que éste absorba el exceso de decolorante y la tira se vuelva transparente. También puede secarse con una fuente de calor hasta que la tira se transparente. Una vez terminado se obtiene la corrida electroforética.

Permite observar las bandas o fracciones de las moléculas separadas: 1º Retirar la tira de la cubeta de electroforesis y sumergirla en colorante por 10 minutos.

Ya que detecta el pasaje de la luz UV, la lectura de los resultados se hace directamente en un ordenador mediante un electroferograma.

LECTURA

INTRODUCCIÓN

Técnica de alta resolución que permite la separación de mezclas de proteínas complejas gracias a su bidimensionalidad.

Se caracteriza porque combina dos tipos de electroforesis:

• Electroenfoque: separación en primera dimensión por pI
• PAGE-SDS: separación en segunda dimensión por PM

CAJA DEL GEL /CUBETA

Depósito compuesto por dos recipientes y un puente:

• Dos recipientes: son dos compartimentos, uno en cada lado, donde verter el tampón de electroforesis.
• Un puente: se encuentra entre los dos recipientes y es donde se deposita el soporte (gel).

La cubeta incorpora los electrodos entre los que se establece el campo eléctrico.

INTRODUCCIÓN

Es el tipo de electroforesis más utilizado y común. Se usa para separar fragmentos de ADN generados por enzimas de restricción, ARN, PCR, etc. Por ello, a esta técnica también se la conoce como electroforesis de ácidos nucleicos.

El medio de separación que se utiliza es la agarosa, un polisacárido derivado del agar, extraído de las algas.

PROCEDIMIENTO

El capilar se llena con el tampón a partir de los viales en los extremos de éste y la muestra en otro vial se introduce también en el capilar por uno de los extremos, de manera que al momento de inyectarlo, uno de los dos viales del tampón se reemplaza por el de la muestra. Se aplica el campo eléctrico con alto voltaje y se monitoriza la separación. Se realiza en columna, situando el detector antes del extremo de salida del capilar para que registre la propiedad física de los analitos y la envíe al ordenador, que la representará en una gráfica.

PROCEDIMIENTO

• Colocar el tampón en la cubeta y sumergir el gel.
• Retirar el peine del gel para dejar los pocillos de siembra descubiertos y rellenarlos con la muestra.

• Llenar 1-2 pocillos con los marcadores del PM.
• Tapar la cubeta y conectarla a la fuente de alimentación con una intensidad y tiempo adecuados.

• El proceso finaliza cuando los componentes se han separado todo lo posible. Los marcadores indican cuándo apagar la fuente de alimentación.

INTRODUCCIÓN

El electroenfoque / isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis que se realiza para separar proteínas según su punto isoeléctrico en un soporte que posee un gradiente continuo de pH. El pI de una proteína es el pH para el que presenta una carga neta compensada. En este punto su solubilidad es mínima y a un pH menor de su pI, las proteínas tienen carga positiva mientras que si el pH es mayor a su pI, su carga será negativa.

FUENTE DE ALIMENTACIÓN

Dispositivo que genera una corriente eléctrica para provocar la migración de los componentes presentes en la mezcla. Se conecta con dos electrodos en la cubeta de electroforesis a través de unos cables con colores distintos. El cable negro corresponde al polo negativo y el cable rojo al polo positivo. Debe mantenerse horizontal y nivelada.

PREPARACIÓN

Paso crítico y más importante de todo el proceso. Se emplean:

• Agentes caotrópicos: provocan la desnaturalización de las proteínas, rompiendo los puentes de H y dejando expuestos los residuos hidrofóbicos.
• Surfactantes: permiten que los residuos hidrofóbicos sean solubilizados.
• Agentes reductores: como el DTT, completan la desnaturalización de las proteínas rompiendo los puentes disulfuro.

PROCEDIMIENTO

Las moléculas se someten a varios campos eléctricos de diferentes orientaciones. El primer campo aplicado provoca el estiramiento de los fragmentos y su cambio de orientación hacia este mismo. Al aplicar un segundo campo eléctrico perpendicular al primero, se obliga a los fragmentos a relajarse, alargándose y reorientándose en dirección al 2º campo.

La separación según el tamaño de los fragmentos se consigue con el sucesivo cambio de los campos eléctricos, siendo que las direcciones de los dos primeros forman un ángulo de reorientación que determina cuánto deben girar los fragmentos de ADN al reorientarse.

REVELADO

Retiramos el gel de la cubeta y le añadimos Bromuro de etidio (BrEt) u otro agente intercalante si no se ha incorporado previamente durante la preparación del gel.

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA