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Caracterización y evaluación de un hidrogel de quitosano con glutaraldehído

Los hidrogeles han sido de suma utilidad en la biomedicina siendo aprovechados en el desarrollo de cultivos celulares 3D, transporte de medicamentos, ingeniería de tejidos, gasas para heridas, entre otros [1]. El desarrollo de los hidrogeles consta de 3 etapas: La primera etapa es la generación y caracterización del proceso fisicoquímico de entrecruzamiento, el segundo es el diseño de la respuesta a un estímulo específico (temperatura, pH, fuerza iónica), y el tercero es el desarrollo de materiales híbridos complejos [2]. A partir de lo anterior, se reconoce el entrecruzante como un componente importante para el desarrollo de un hidrogel que tenga las características de interés que pueden ser sintetizados mediante distintos métodos de polimerización usando entrecruzantes físicos y/o químicos [3]. Al considerar el primer paso para el desarrollo del hidrogel y la influencia del entrecruzante en su síntesis, el presente trabajo busca sintetizar un hidrogel de quitosano usando glutaraldehído como entrecruzante, evaluar sus propiedades y analizar el efecto de variar su concentración con tal de comprender de manera práctica la naturaleza del polímero.

Caracterización de superficie

Síntesis de los hidrogeles

Caracterización mecánica

Esterilidad y control microbiológico

Actividad antimicrobiana

Caracterización térmica

Prueba de hemólisis

Caracterización espectroscópica

Resultados

Metodología

Por medio del control microbiológico se comprobó la eficacia por esterilización con luz UV ya que no se observaron organismos sobre el hidrogel ni en el caldo; Aunque los resultados fueron satisfactorios aun existe la probabilidad de que este tipo de esterilización no funcione en muestras de mayor tamaño ya que este tipo de esterilización es superficial. [5]

La prueba de esterilidad se llevo a cabo mediante diferentes métodos, como la autoclave, la radiación ultravioleta y la filtración por membranas. Para el caso del hidrogel se realizo esterilizacion por UV con unas condiciones de longitud de onda de 253 nm para la luz y se realizo durante 20 minutos y por membranas mediante filtros de geringa con un tamaño de poros de 0.22 µm. Después de la esterilización, se realiza una verificación microbiológica para garantizar la eficacia del proceso, mediante pruebas de incubación y análisis de turbidez en medios de cultivo. Se realizaron un tipo de cultivo en caldo de cultivo liquido el cual era esterilizado con anterioridad y despues de introducir el hidrogel esterilizado se ponia a incubar durante 24 horas a 37°C.

Resultados

Metodología

Las 4 muestras de hidrogel químico con distinta cantidad de entrecruzante fueron evaluadas en el TGA PT100, marca LINSEIS. En crisoles estériles se ubicaron en promedio 4mg de cada muestra. Posteriormente se introdujeron en el dispositivo para obtener la gráfica de %peso vs. Temperatura con lecturas hasta 449 °C. Los resultados fueron analizados en el software RStudio (versión 4.3.2) utilizando el paquete ‘ggplot2’ (versión 3.4.4).

La importancia del TGA radica en determinar la composición y estabilidad térmica del material. Según [14], la estabilidad térmica es importante en el desarrollo de hidrogeles debido a su naturaleza de contener agua en su estructura, por lo que son propensos a perder agua fácilmente en altas o bajas temperaturas. Mejorar su estabilidad térmica bajo distintas temperaturas de trabajo es necesario para adaptarse a distintos ambientes presentes en el cuerpo. Ahora bien, los resultados indican que el hidrogel que presenta una mayor estabilidad térmica es aquel con un volumen de entrecruzante de 75uL, ya que su pérdida de masa es menor a comparación de las demás tanto en el 80% de su peso como en el 50% a altas temperaturas.

Metodologia

Resultados

El procedimiento comienza con la preparación del agar y el cultivo, seguido por la activación de bacterias congeladas. Luego, se prepara el hidrogel con ácido acético y quitosano, seguido por la preparación del inóculo de bacterias. Las bacterias se distribuyen en placas de Petri, la mitad de los discos con antibióticos como control positivo y otras con papel filtro contaminado de hidrogel como prueba. Después de la incubación, se registran los resultados, midiendo el halo de inhibición. Se esperan halos de inhibición en las placas con hidrogel de quitosano, demostrando su actividad bactericida.

La bacteria S. aureus, hace parte de la familia coccus, como podemos ver en las imagen, no hubo crecimiento de bacteria en ninguno de los lados (lado positivo o el lado del hidrogel)[6][7]. Se esperaba un halo de inhibición en el lado positivo y en los hidrogeles, esto significa que hubo un error al realizar el experimento ya que el lado positivo que debería ser el control también tiene falta de bacterias a su alrededor. Se piensa que el error estuvo en varios pasos del proceso: pudo haber una baja cantidad de concentración de la bacteria, las bacterias se pudieron morir al tenerlas cerca al fuego para su esterilización, se cultivó mal o hasta se pudo matar las bacterias al insertar el “recogedor” cuando estaba muy caliente. [6][7]Para el E.coli, por un descuido se trato el petri bruscamente causando el antibiótico y el hidrogel moverse exageradamente por todo el petri. Afortunadamente, aún se puede observar en la imagen el crecimiento de bacterias y el desarrollo de un halo de inhibición en el antibiótico y en el hidrogel. Esto siendo el resultado esperado.

Resultados

Metodología

Gracias a la prueba de hemolisis se pudo comprobar las propiedades biocompatibles del hidrogel. Los resultados de esta práctica mostraron un porcentaje de hemólisis del 0.0159% para glóbulos rojos y 0.0051% para plaquetas esto quiere decir que hubo una hemolisis mínima o prácticamente ausente lo que significa que el hidrogel no va a ser un riesgo para los glóbulos rojos y las plaquetas del paciente. [8]

Se siguió el procedimiento para la obtención de extractos donde se sumergió el material en PBS durante 24 horas a 37°C, seguido de una centrifugación. En el caso de precipitación del material, se extrajo el sobrenadante y posteriormente se pasó por un filtro de jeringa. Luego, para la prueba de hemólisis, se prepararon eritrocitos al 10% en PBS 1X, los cuales se incubaron con el extracto del material durante 1 hora a 37°C y 5% de CO2. Por último, se realizó una centrifugación y se midió la absorbancia a 450nm del sobrenadante junto con los controles positivos y negativos tanto para glóbulos rojos como plaquetas para calcular el porcentaje de hemólisis.

Referencias

[1] T.-C. Ho et al., “Hydrogels: Properties and Applications in Biomedicine”, Molecules, vol. 27, núm. 9, p. 2902, may 2022, doi: 10.3390/molecules27092902.[2] A. Revete et al., “Advancements in the Use of Hydrogels for Regenerative Medicine: Properties and Biomedical Applications.”, Int J Biomater, vol. 2022, p. 3606765, 2022, doi: 10.1155/2022/3606765. [3] J. Maitra y S. Vivek-Kumar, “Cross-linking in Hydrogels - A Review”, American Journal of Polymer Science, vol. 4, núm. 2, pp. 25–31, 2014. [4] R. Gadhave, P. Mahanwar, y P. Gadekar, “Effect of glutaraldehyde on thermal and mechanical properties of starch and polyvinyl alcohol blends”, Des Monomers Polym, vol. 22, pp. 164–170, abr. 2019, doi: 10.1080/15685551.2019.1678222. [5] Medigraphic - Literatura Biomédica. Accedido el 8 de abril de 2024. [En línea]. Disponible: https://www.medigraphic.com/pdfs/micro/ei-2021/ei212e.pdf [6] “Prueba de Cultivo de Bacterias: Prueba de Laboratorio de Medlineplus,” MedlinePlus, https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-laboratorio/prueba-de-cultivo-de-bacterias/ (accessed Apr. 7, 2024). [7] M. L. Herrera, “Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana: Métodología de Laboratorio,” Revista Médica del Hospital Nacional de Niños Dr. Carlos Sáenz Herrera, https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1017-85461999000100010 (accessed Apr. 7, 2024). [8]Accedido el 8 de abril de 2024. [En línea]. Disponible: http://www.siea.uaemex.mx/siestudiosa/FrmBoletin/Boletin69/59.pdf [9] K.-Y. Law, “Definitions for Hydrophilicity, Hydrophobicity, and Superhydrophobicity: Getting the Basics Right”, J Phys Chem Lett, vol. 5, núm. 4, pp. 686–688, feb. 2014, doi: 10.1021/jz402762h. [10] X. Yang, H. Cui, Z. Wang, W. Wang, H. Guo, y X. Wang, “Influence of crosslink on the formation of hydrophobic hydrogels”, Polym Test, vol. 124, p. 108103, jul. 2023, doi: 10.1016/j.polymertesting.2023.108103. [11] “Ácido sulfúrico - facultad de química,” HOJA DE DATOS DE SEGURIDAD DE SUSTANCIAS QUÍMICAS:ACIDO SULFURICO, https://quimica.unam.mx/wp-content/uploads/2017/05/HDS-Acido-sulfurico-NOM-018-2015-MARY-MEAG-Hoja-de-datos.pdf (accessed Apr. 8, 2024). [12] L. A. P. Sánchez, A. B. Ballén, and L. C. S. Marchand, “Preparación y Caracterización de una película de Quitosano plastificado: Un biomaterial de gran potencial en el Campo de la Medicina,” Reto, https://revistas.sena.edu.co/index.php/RETO/article/view/2510 (accessed Apr. 7, 2024). [13] “Los Tres Pilares de la Bioquímica del Agua,” McGraw-Hill, https://www.mheducation.es/blog/los-tres-pilares-de-la-bioquimica-del-agua (accessed Apr. 7, 2024). [14] F. Xin y Q. Lyu, “A Review on Thermal Properties of Hydrogels for Electronic Devices Applications”, Gels, vol. 9, núm. 1, p. 7, dic. 2022, doi: 10.3390/gels9010007. [15] Merck, “Fotometría y reflectometría”, https://www.sigmaaldrich.com/CO/es/applications/analytical-chemistry/photometry-and-reflectometry. [16] J. P. Hawranek, P. Neelakantan, R. P. Young, y R. N. Jones, “The control of errors in i.r. spectrophotometry—IV. Corrections for dispersion distortion and the evaluation of both optical constants”, Spectrochim Acta A, vol. 32, núm. 1, pp. 85–98, ene. 1976, doi: 10.1016/0584-8539(76)80055-4.

Resultados

Metodología

Se presencian absorbancias relevantes para cada pico leídas desde la tabla brindada por [15]:

• 651,5: Cercano a una estructura bencénica meta.
• 1032.9, 1070.0,1408.1: Nuevos grupos funcionales posiblemente formados por las reacciones de polimerización y entrecruzamiento entre el quitosano y el glutaraldehído
• 1552,4: Vibración de flexión del grupo amida NH en el quitosano. 1643,1: Vibración de estiramiento del grupo NH en el quitosano.
• 2878,0: Vibraciones de estiramiento de los grupos CH2 en el glutaraldehído
• 3259,4: Vibración de estiramiento de los grupos OH y NH presentes en el quitosano.

.

La caracterización espectroscópica fue llevada a cabo por FTIR obteniendo el espectro con el espectrómetro ALFA II FTIR, marca Bruker. Primero, se neutralizó el pH del scaffold del hidrogel químico, se limpió el detector con agua tipo II y alcohol. Posteriormente, se ubicó el scaffold sobre el lector y se estableció un rango de lectura de longitud de onda de 400-4000nm. Por último, se obtuvo la gráfica brindada por el espectrómetro para cada muestra química.

• Grupo 1: 50 uL
• Grupo 2: 75 uL
• Grupo 3: 150 uL
• Grupo 4: 250 uL

Resultados

Metodología

Los resultados obtenidos de ImageJ se presentan abajo. Se evidencia que el ángulo de contacto del hidrogel químico (16.470°) es mayor que el del físico (1.727°). De acuerdo con [9], el material se considera hidrobófico si su ángulo de contanto es mayor a 90 grados (>90°C) e hidrofílico si es menor (<90°C). Dado que los dos son menores a 90°, se consideran hidrofílicos. Sin embargo, ya que el hidrogel químico presenta un mayor ángulo de contacto se puede decir que es más hidrofóbico que el hidrogel físico. Esto es de espererarse ya que, según [10], si bien el entrecruzante puede aumentar la hidrofobicidad del hidrogel, no es altamente significativo.

La prueba de superficie utilizada fue la de ángulo de contacto. Esta prueba mide la hidroboficidad del biomaterial. La prueba se realizó con una sola muestra para ubicando un pedazo del hidrogel físico y una del hidrogel químico en una lámina cada uno. Se moldearon de tal forma que se generara una superficie lo suficientemente lisa y se aplicó por encima una gota de agua. Se grabó desde que se suelta la gota hasta que se estabblece sobre la muestra. Usando el programa ImageJ se obtuvo el ángulo de contacto formado entre el agua con la superficie.

Video

Resultados

Metodología

• Degradación hidrolítica: En la degradación hidrolítica de scaffolds se evidenció un cambio de pH muy bajo con una variación de 0 a 1. Los resultados fueron los esperados considerando las propiedades hidrofílicas y de resistencia a la degradación superficial por parte del scaffolding del quitosano debido al poco o casi nulo aumento de pH en el ácido sulfúrico por el pH teórico de este ácido a 0,1 M siendo 0.96 [11][12][13].
• Prueba de hinchamiento: Para el hinchamiento del hidrogel se obtuvo un peso inicial de 0.8829gr y un peso final de 9.06 gramos después del día de incubación teniendo propiedades hidrofílicas muy notables por el incremento de peso tan drástico gracias a su afinidad con las moléculas de agua. Esto se esperaba al revisar la estructura del quitosano y ver sus grupos funcionales y su carga polar [13].

La metodología para la prueba de hinchamiento implicó pesar previamente el hidrogel químico liofilizado (scaffold), agregar una gota de agua, incubar a 37 °C por 24 horas y pesar nuevamente. Para la degradación hidrolítica de scaffolds se pesó el material previamente, se sumergió en ácido sulfúrico 0.1M y se midió el pH en intervalos de tiempo entre 1h, 5h, 1d y 2d después con un indicador de pH. Al finalizar se retiró el sobrenadante y se pesó el scaffold.

Bioética

Autonomía

Bieneficiencia

Non-malifeciencia

Justicia

Resultados

Metodología

Se sintetizaron dos hidrogeles: el químico, el cual posee entrecruzante (glutaraldehído) y el físico, el cual no tiene. Los dos hidrogeles fueron hechos a partir de 0.25g de quitosano (2% p/v) en ácido acético al 2% (v/v). Para evaluar el efecto de la cantidad de entrecruzante en las propiedades del hidrogel químico, se utilizaron los siguientes volúmenes.

Cualitativamente, para todos los hidrogeles, el hidrogel químico (izquierda) presenta un color amarillento y una textura más viscosa que el hidrogel físico (derecha). Esto es de esperarse debido a que el glutaraldehído como agente entrecruzante aumenta la longitud de las cadenas poliméricas del hidrogel y, por consiguiente, su viscosidad [4]. Cadenas más largas implican mayores interacciones intermoleculares como las fuerzas de Van der Waals, lo que disminuye el flujo y movilidad de las cadenas en la solución.

Conclusión

A partir de las pruebas obtenidas se pudo concluir lo siguiente sobre el hidrogel sintetizado usando glutaraldehído como entrecruzante:

1. El entrecruzante aumenta la viscosidad del hidrogel
2. El hidrogel con 75ul presenta la mejor estabilidad térmica
3. La concentración de entrecruzante no influye en la formación de otros grupos funcionales.
4. El entrecruzante puede influir en la cantidad de agua absorbida por el hidrogel.
5. La hemólisis del hidrogel con 150uL de glutaraldehído no es riesgoso en presencia de glóbulos rojos

Con los siguientes resultados, a pesar de que no se obtuvieron todos los resultados esperados, fue posible entender la interacción entre el quitosano y el entrecruzante en cuanto a sus propiedades físicas y químicas.