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Aislamiento y descripción de microorganimos

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Created on March 24, 2024

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Fundamentos de microbiología

UNIDAD III. Caracteristicas mofologicas de los microorganismos

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TeMA I. Técnicas de siembra para aislamiento y propagación de microorganismos.

Siembra de microorganismos

Cultivar microorganismos significa promover de forma intencional su crecimiento en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. Para favorecer el desarrollo de un microorganismo en particular, es necesario considerar el aspecto nutricional y las condiciones ambientales de su hábitat natural. Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables, deben cumplir con los siguientes requisitos:

Disponibilidad de nutrientes.
Se debe contar con fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, sales y agua.
Consistencia adecuada del medio.
Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases.
Condiciones adecuadas de humedad.
Luz ambiental.
pH adecuado.
Temperatura.
Esterilidad.

Durante la incubación de un microorganismo se deben controlar variables como la temperatura, humedad, luminosidad y aeración.

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

Que se efectúen asépticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero fisher o bunsen

Para que los microorganismos de interés se desarrollen en los medios de cultivo es necesario tomar, en condiciones de asepsia, un inóculo o muestra a partir de otro cultivo o de un material contaminado. A este proceso se le denomina sembrado o inoculación.En el sembrado de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas graduadas o pipetas Pasteur que deberán esterilizarse previamente. El uso de estos materiales depende del inóculo y del medio en el cual se desea sembrar. Si el inóculo es sólido puede sembrarse en un medio líquido usando un asa bacteriológica o un hisopo. Si el inóculo es líquido, se usa una pipeta graduada o una pipeta Pasteur.

Esterilización del asa bacteriológica

Técnicas de siembra en placa

Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.
Siembra por inmersión: Se coloca el inóculo en una placa o caja Petri y sobre le mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganimso aerobios.
Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar.

Siembra volumétrica: Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no puede ser predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos.
Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de cultivo sólido imprimiéndo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.

Técnicas de siembra en tubo

Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.

Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.
Siembra por punción. El instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de cultivo.

aislamiento

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos AXÉNICOS O PUROS. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de COLONIA.. Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.

CULTIVO AXÉNICO

Describe un cultivo en el que solo una especie, variedad o cepa de organismo está presente y completamente libre de todos los demás organismos.
Los cultivos axénicos son muy extraños en la naturaleza.
El cultivo axénico es una herramienta importante para el estudio de organismos simbióticos y parásitos en un ambiente controlado.
Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en un laboratorio.
Los cultivos axénicos de microorganismos se preparan típicamente por subcultivo de un cultivo mixto existente.

Técnica de aislamiento por estría escocesa

La siembra por estría escocesa es un método cualitativo de aislamiento de microorganismos por agotamiento en placa a partir de una muestra natural o de un cultivo de laboratorio. Este método está basado en arrastrar, mediante un asa de siembra. Es un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa.

Técnica de agotamiento de asa

A partir de un cultivo mixto, agitar para homogeneizar su contenido. Flamear el asa bacteriológica y tomar una muestra del cultivo. Flamear la boca del tubo tanto al abrirlo como antes de cerrarlo.En una placa con agar nutritivo y tocando con suavidad la superficie del medio. El recorrido del asa debe ser lo más largo posible con el fin de conseguir al final del mismo células aisladas que darán lugar a colonias. Al destapar la placa de Petri mantener la tapa en la mano, abriéndola sólo lo necesario para realizar la siembra. Después de sembrar cerrar la placa y dejar en posición invertida para llevar a incubar a 37ºC.

Diversos tipos de estriados

TÉCNICAS BÁSICAS DE AISLAMIENTO DE MICROBIOLOGÍA

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Técnica por dilución

Esta técnica permite el aislamiento de colonias y además el recuento de los microorganismos que tenemos en el cultivo inicial. Se trabaja con tubos con suero fisiológico estéril, uno de ellos con 10 ml y el resto con 9 ml. Mediante una micropipeta con una punta estéril tomar 1 ml del cultivo mixto y depositarlo en el primer tubo. Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea. Tomar otra pipeta estéril y de este primer tubo transferir 0,1 ml al segundo tubo, agitar y repetir la operación transfiriendo 1ml del segundo al tercer tubo, del tercero al cuarto y del cuarto al quinto.Una vez realizado el banco de diluciones procederemos a sembrar los últimos tubos 0,1 ml en placas de agar nutritivo, mediante la técnica de siembra por extensión. Se depositan los 100 microlitros en la superficie del agar y se debe extender la muestra en toda la superficie del mismo, utilizando para ello el asa de vidrio. Para esterilizar el asa de vidrio, en primer lugar se introduce en alcohol y se flamea encendiéndola con la llama del mechero bunsen. Dejar que se consuma la llama y abriendo la placa lo justo para introducir el asa, extender la muestra arrastrándola con la base del triángulo por toda la superficie del medio hasta que éste absorba toda el agua. Incubar a 37ºC durante 24 horas y realizar el recuento de las colonias calculando la concentración de células en el tubo inicial mediante la fórmula: ufc / ml = N x D x 10 Donde: ufc = unidades formadoras de colonias D = dilución N = nº de colonias

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