2025-II Técnicas de ADN recombinante

Técnicas de adn recombinante

Biosítesis y Biotecnología 2025-IIFacultad de Química UNAM

EMPEZAR

M. en C. Karla Montserrat González Reyes

"The recombinant DNA breakthrough has provided us with a new and powerful approach to the questions that have intrigued and plagued man for centuries".

Paul Berg

Biotecnología moderna

Nace con...

Watson y Crick quienes descifraron la estructura del ADN en 1953 utilizando el conocimiento de las leyes de Chargaff y la cristalografía de rayos X de Maurice Wilkins y Rosalind Franklin.

Algunos eventos históricos

1958

1970

1975

1979

1981

Producción in vitro de un gen.

Primer anticuerpo monoclonal utilizado para diagnóstico.

Purificación de ADN polimerasa.

Desarrollo de la técnica Southern blot.

Síntesis de insulina usando ADN recombinante.

1983

1985

1990

1994

1998

Plásmido Ti se usa para transformar plantas.

Desarrollo de la técnica de PCR.

Primer cultivo fértil transgénico de maíz.

Producción de anticuerpos monoclonales en ratones.

Primer mamífero clonado, la oveja Dolly.

Endonucleasas de restricción

Descubiertas en 1960 por Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith.

• Tipo I y III cortan lejos del sitio de union. Usadas para degradar ADN exógeno.
• Tipo II cortan justo en el sitio de unión. Usadas para reparar fragmentos específicos del ADN.

Este descubrimiento habilita el desarrollo de la ingeniería genética.

Bam HI

1970

Howard Temin y David Baltimore descubren la transcriptasa reversa.

Permite tener fragmentos de ADN codificantes.

1973

Construcción de un plásmido por Cohen y Boyer.

• El ADN recombinante se replica en bacterias.
• Se puede otorgar resistencia a antibióticos a la célula husesped.

1975

Secuenciación de ADN por Sanger

1982

En 1982 la Humulin fue aprobada por la FDA convirtiéndose en el primer producto de la biotecnología moderna que entró al mercado. Éste producto fue desarrollado por Eli Lilli & Company y Genentech

• Producida en E. coli.
• Libre de contaminantes de origen animal.
• Menor riesgo de reacciones alérgicas.
• Mayor disponibilidad.

1985

Desarrollo de la PCR por Kary Mullis

1990

Proyecto genoma humano

Mutación

Técnicas de obtención de mutantes

Transformación

Conjugación

Células HFR

Alta freciencia de recombinación

Plásmidos

Sitio de replicación reconocido por la célula hospedera

Promotor para la expresión de los genes, puede ser iducible

Genes que confieren resistencia a antibióticos

Genes a expresar

Genes que funcionarán como marcadores de selección

Plásmido de expresión

Transducción

Seleción del vector

1. Capacidad adecuada.
2. Indetectable para el sistema inmune.
3. Duración adecuada de la exresión.
4. Seguro para el sistema.

Transducción

Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens)

Microinyección

Recombinación

Biobalística

CRISPR-Cas9

Secuenciación

Secuenciación

Sistemas heterólogos

• Métodos de obtención de ADN.
• Organismo hospedador.
• Métodos de inserción de ADN

1. Complejidad de la molécula.
2. Uso de la molécula.
3. Cantidad del producto.
4. Economía.
5. Aspectos regulatorios

Bacterias

Convenientes para el crecimiento en grandes fermentadores.

• Altos rendimientos: 0.1-5 g/L.
• Cuerpos de inclusión.
• Sin modificaciones postraduccionales.
• Metionina en el extremo N-terminal.

Bacterias

Convenientes para el crecimiento en grandes fermentadores.

• Altos rendimientos: 0.1-5 g/L.
• Cuerpos de inclusión.
• Sin modificaciones postraduccionales.
• Metionina en el extremo N-terminal.

Levaduras

Convenientes para el crecimiento en grandes fermentadores.

• Buenos rendimientos: 0.1-1 g/L.
• Modificaciones postraduccionales: glicosilación, puentes disulfuro, procesamiento proteolítico.
• Clonación, expresión funcional, identificación, sobreexpresiones.

Células de ovario de hámster chino (CHO)

Convenientes para investigación.

• Modificaciones postraduccionales-

Células de insecto

Expresión mediada por Baculovirus, las células infectadas se cultivan en suero.

• Spodoptera frugiperda (SF9).
• Pruebas de producción de proteínas membranales en bajas concentraciones.

Células de insecto

Expresión mediada por Baculovirus, las células infectadas se cultivan en suero.

• Spodoptera frugiperda (SF9).
• Pruebas de producción de proteínas membranales en bajas concentraciones.

Células vegetales

• Modificaciones postraduccionales.
• Expresión localizada.
• Expresión en estadíos específicos de crecimiento.
• Crecimiento en campo.
• Patrones de glicosilación diferentes.
• La transformación y expresión tienen eficiencias bajas.
• Seguridad controvertida.

Células de mamífero

• Rendimientos bajos 0.001-0.1 g/L
• Se producen modificaciones postraduccionales.
• Uso de hibridoma.

gracias

Gracias al M. en C. Román Alfonso Castillo Díaz por sus aportaciones a esta presentación.