2025-I Downstream de un proceso biotecnológico

Downstream de un proceso biotecnológico

Biosíntesis y Biotecnología2025-I

Aspectos a considerar para selecionar un método de purificación.

Características

Uso del producto

tamaño, carga, solubilidad, hidrofobicidad o función biológica.

p.e. enzima: determinaremos la actividad, secuencia de aminoacidos o conformación tridimensional.

Costo

Cantidad requerida

¡NO HAY UN PROCEDIMIENTO ÚNICO PARA LA PURIFICACIÓN!

Tomar en cuenta...

Objetivos de purificación

Remover contaminantes al inicio

Pureza, cantidad y actividad requeridas.

Por ejemplo las proteasas.

Muestra biológica de inicio

Reducir el uso de aditivos

Intracelular o extracelular.

No modificar la solución amortiguadora.

Técnica de análisis

Técnica diferente en cada paso

Determinación rápida de la pureza.

No mejora sustanciancialmente la pureza y diminuye el contenido de producto.

Minimizar la manipulación de la muestra

Minimizar el número de pasos

Pérdida de producto y tiempo. Generalmente los procesos downstream contienen entre 5 y 8 pasos diferentes.

Evitar los procedimientos largos.

Secuencia

Caldo de fermentación

con células

Separación de células

sin células células inmovilizadas

Rompimiento célular

sobrenadante

Separación, tratamiento de cuerpos de inclusión

Concentración

Purificación de alta resolución

Refinamiento

Técnicas de purificación

Cromatografía de exclusión molecular

Cromatografía de afinidad

Obtención del extracto

Remoción de solutos y concentración de proteínas

Cromatografía de intercambio iónico

Separación por precipitación

Sedimentación por centrifugación

Cromatografía HPLC

Obtención de un extracto

Ruptura de células

Métodos mecánicos

Homogenización

Extrusión por presión

molienda

Sonicación

Métodos no mecánicos

Procesamiento del extracto

Ciclos de congelamiento- descongelamiento. Lisis enzimática. Lisis con detergentes. Choque osmótico.

• Elección de la solución amortiguadora de extracción (pH, concentración, aditivos).
• Remoción de partículas insolubles.
• Temperatura de trabajo.

Métodos químicos

Métodos químicos

Métodos químicos

Métodos mecánicos

Susceptibilidad a la ruptura celular

Mamifero

Micelio

Bacterias Gram +

Bacterias Gram -

Levaduras

Esporas

Separación por precipitación

• Temperatura
• pH
• Adición de solventes
• Adición de sales
• Adición de agentes bioespecíficos

Sedimentación por centrifugación

Centrifugación diferencial o gradiente de densidad.

Cromatografía de exclusión molecular

Compuestos de pesos moleculares mayores a 1 kDa

• Purificación
• Desalado
• Cambio de solución amortiguadora
• Determinación de radio hidrodinámico
• Estructura cuaternaria

Cromatografía de intercambio iónico

catiónico

aniónico

• Purificación
• Concentración de la muestra
• Cambio de solución amortiguadora
• Desionización de agua

Elución por cambio de fuerza iónica o pH

HPLC

• Moléculas son separadas de acuerdo a su polaridad
• Se emplean altas presiones: 40 MPa

Fase normal

Fase estacionaria polar y fase móvil no polar.

Fase reversa

Fase estacionaria no polar y fase móvil de polaridad moderada

Cromatografía de afinidad

• Purificación específica
• Concentración de la muestra
• Alta resolución
• Sencilla

Remoción de solutos y concentración de proteínas

Diálisis

Ultrafiltración

Gracias porsu atención

M. en C. Karla M. González Reyes