Tècniques de Separació

Tècniques

de Separació

TEMA 5

Índex

4.1. Electroforesi

5. Separació a partir de la solubilitat

1. Introducció

5.1. Extraccions amb dissolvents

2. Classificació

5.2. Cromatografies

3. Separació a partir de propietats físiques

3.1. Filtració

3.2. Decantació

3.3. Centrifugació

4. Separació a partir de propietats electroquímiques

Introducció

Definició i aplicacions.

Introducció

Les tècniques de separació permeten obtenir tots o alguns components d'una mescla.

Aplicacions:

• Purificar una mostra (eliminar-ne les impureses).
• Obtenir una de les substàncies presents a la mostra pel seu posterior estudi o aplicacions concretes.
• Identificar la presencia d'una substància en la mescla.
• Quantificar la concentració d'una substància en la mescla.

Classificació

Segons la propietat en la que es basen, segons la quantitat de mostra i segons la fase analítica.

Segons la propietat

Propietats electroquímiques

Propietats físiques

Solubilitat

• Densitat
• Mida de la partícula
• Forma de la partícula

• Diferència de mobilitat en un camp elèctric

• Solubilitat en un dissolvent

EXEMPLES

EXEMPLES

Exemples

Altres criteris de classificació:

Segons la quantitat de mostra:-Aplicat a tota la mostra (filtració) -Aplicat a una petita part = alíquota (electroforesi)

Segons la fase analítica:-Preparació mostra fase preanalítica (centrifugació de la sang) -Fase analítica

Separació a partir de propietats físiques

Separació a partir de propietats físiques

La Filtració

Mètode mecànic de separació de suspensions en funció de la mida de les partícules. Consisteix en passar la suspensió a través d'un medi porós denominat filtre. Objectiu: obtenir el residu, el filtrat o ambdós.

FILTRAT

residu

Separació a partir de propietats físiques

La Filtració

Els filtres:

Tipus de filtres

Dispositiu de material porós que permet el pas del líquid i reté partícules amb diàmetre superior al del porus del filtre. Clarifica el líquid = allibera de les partícules que duu en suspensió. Quan hi ha moltes partícules retingudes i no pot passar més líquid, es diu que el filtre està col·lapsat i s'ha de substituir.

S'utilitzen diferents materials per filtrar.

De membrana

DE paper

De vidre molt o plaques filtrants

Separació a partir de propietats físiques

La Filtració

Al buit

Per gravetat

Esterilitzant

Separació a partir de propietats físiques

La Filtració per gravetat

Posem el filtre (llis o amb plecs) a l'embut i un objecte de recollida a sota. El filtre ha de quedar ajustat i un poc per sota de l'extrem superior de l'embut.

Aboquem el líquid sobre el paper de filtre. Mai omplir més que fins als 6mm de l'extrem del paper.

Líquid travessa el filtre i cau al recipient de recollida. La fracció sòlida queda retinguda.

Separació a partir de propietats físiques

La Filtració al buit

Posar filtre de paper a l'embut buchner i humitejar per a que el paper s'uneixi a l'embut.

Acoblar l'embut a un matràs Kitasato, fent passar el tub per el tap del matràs.

Acoblar tub de goma a l'embocadura lateral del matràs. Per l'altre extrem, acoblar a bomba del buit.

Abocar el líquid a l'embut i connectar la bomba que fa efecte de succió i accelera la filtració

QUAN L'UTILITZAM?

Separació a partir de propietats físiques

La Filtració esterilitzant

S'utilitza per a eliminar microorganismes de líquids sensibles a la calor (i que, per tant, no es poden esterilitzar a l'autoclau). Fonament: fer passar el líquid per filtres amb porus prou petits perquè no passin els microorganismes (filtres de membrana) però sí els líquids.

Tipus de filtració esterilitzant:

Es pot ajudar d'una xeringa o bomba de buit per forçar el pas a través del líquid. Abans de filtrar s'ha d'esterilitzar el filtre i els utensilis emprats. Com els porus són petits, es col·lapsen fàcilment i, per tant, només es poden filtrar suspensions molt diluïdes (poques partícules en suspensió).

Com evitem que es col·lapsi?

Decantació

Separació a partir de propietats físiques

Mètode mecànic de separació de mescles heterogènies sòlid-líquid (suspensions) o líquid-líquid (emulsions) en funció de la densitat dels components gràcies a l'acció de la gravetat. La decantació de suspensions també rep els noms de clarificació i sedimentació. És menys eficaç que altres mètodes de separació. És habitual utilitzar-lo com a pas previ a una filtració o centrifugació quan hi ha moltes partícules en suspensió.

Què és la densitat?

com es fa?

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

Mètode mecànic de separació de mescles heterogènies sòlid-líquid (suspensions) o líquid-líquid (emulsions) gràcies a la força centrífuga. Fonament: accelerar la sedimentació gràcies a la gravetat, fent que la mostra giri ràpidament És més efectiva i ràpida que la decantació perquè la força centrífuga és més intensa que la gravetat.

coeficient de sedimentació

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

la centrífuga

Força centrífuga

Equip que s'utilitza per a centrifugar. Consta de:

Força que gira el rotor en rpm (revolucions per minut).

• Rotor: gira al voltant d'un eix central.
• Motor elèctric: fa girar al rotor.
• Habitacle o funda: on es col·loquen els tubs amb la mostra que volem centrifugar.

Força centrífuga relativa

Força que s'exerceix sobre les partícules.

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

la centrífuga

Controls de la centrífuga:

• El temps de centrifugació.
• La velocitat de gir: depèn del model i pot estar entre 3.000 i 50.000 rpm.
• La temperatura: si els components són termolàbils l'hem de controlar.

Per col·locar els tubs hem de tenir en compte:

• Equilibrar el pes dins del rotor de la centrífuga.
• Posar els tubs per parelles en fundes oposades.
• Si només centrifuguem un tub: omplim un altre tub amb aigua que pesi igual a la banda contrària del rotor.
• Així s'evita que hi hagi vibracions o es trenqui la centrifuga o els tubs.

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

Després d'una centrifugació estàndar obtenim:

• Precipitat o pellet

Component de major densitat que sedimenta en la part més allunyada de l'eix de rotació.

• Sobrenedant

Component de menor densitat que queda damunt el precipitat.

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

Classificació

Segons la velocitat de centrifugació

Segons el tipus de rotor

Segons la seva funció

• Microcentrífugues
• Citocentrífugues
• Microhematocrit

• Angular o d'angle fix.
• Flotant o basculant.
• Vertical.

• Centrífugues de baixa velocitat o de sobretaula.
• Centrífugues d'alta velocitat
• Ultracentrífugues

INFORMACIÓ

INFORMACIÓ

INFORMACIÓ

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

Tipus de centrifugació

Analítica

Preparativa

Preparativa diferencial

Centrifugació zonal

Preparativa en gradient de densitat

Centrifugació isopícnica

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

Les centrifugacions preparatives tenen moltes aplicacions:

Obtenció de serum o plasma

Fraccionament subcel·lular

Obtenció de leucocits

Concentració de cèl·lules

Extracció de biomolècules

Separació a partir de propietats físiques

Centrifugació

Manteniment

Ús

Desconnectar de la xarxa quant no s’usa durant molt de temps. Manteniment diari: ◦ Netejar les superfícies amb un drap que no deixi fibres, banyat amb aigua sabonosa.◦ Si es trenca un tub: netejar i desinfectar tota la part interior.Manteniment mensual: ◦ Ajustar els rotors i lubricar els punts que ens recomani el fabricant.◦ Verificar el correcte tancament de la tapa de la centrífuga Manteniment anual: servei d’electromedicina ◦ Examinar l’exactitud dels controls de temps.◦ Verificar la velocitat de rotació real amb un tacòmetre o amb un fototacòmetre.◦ Confirmar el funcionament del sistema de freno ◦ Verificar el funcionament del sistema de refrigeració

Lluny de zones de calor Espai lliure de 30 cm als costats. 1. Col·loquem els tubs: ◦ Evitem vibracions ◦ Comprovem que els tubs estan correctament tapats. ◦ Equilibrem la càrrega ◦ Tapem bé la centrífuga 2. Seleccionem la velocitat i el temps 3. Al acabar, obrir la centrífuga i treure els tubs.

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Les electroforesis són tècniques de separació de mescles que es basen en la diferència de mobilitat de les molècules que la formen, en un camp elèctric.Com ho fem?

• Posem la mostra en un suport.
• Apliquem un camp elèctric.
• Les partícules migren a diferents velocitats a causa de les propietats fisicoquímiques que presenten.
• Obtenim fraccions separades.

Totes les molècules han de tenir la mateixa càrrega, per tant, s'han de desplaçar cap al mateix pol.

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Equip bàsic

Font d'alimentació elèctrica

Suport

Cubeta

• Matriu on es diposita la mostra a analitzar.
• Els extrems estan en contacte amb la solució tampó dels recipients de la cubeta (sobre el pont).

• No té càrrega

Consta de:

• 2 recipients
• 1 pont

Subministra la diferència de potencial necessària perquè migrin els components de la mescla.

COM HO FA?

com es col·loca?

TIPUS

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Sembrar la mostra

Preparació i ús de l'equip

Si les molècules tenen càrrega positiva, les posem prop de l'ànode perquè migrin cap al càtode. Si les molècules tenen càrrega negativa, les posem prop del càtode perquè migrin cap a l'ànode.

Preparació del tampó

Preparar la dissolució.

Preparació del suport

Preparar el gel en concentració adequada i dipositar-lo en un motlle per a tenir un gruix i textura adequada.

Preparació de la mostra

Centrifugació de la mostra per aconseguir concentrar la substància a valorar.

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Preparació i ús de l'equip

Revelat i lectura

Revelat: Posar de manifest les bandes o fraccions en què ha estat separada la mostra.

• El procediment depèn del tipus d'electroforesi que s'hagi fet.
• El més habitual és afegir colorant i un rentat posterior.

Cada banda correspon a una substància diferent. Si les bandes són clares, considerem que l'electroforesi té una bona resolució.

Sèrie de bandes sobre el suport.

Resultat

Lectura: interpretació de la informació que proporciona el revelat.

• La quantificació es pot fer per espectrofotometria, densiometria, etc.

Selecció de paràmetres

Paràmetres elèctrics, el temps i posar en marxa l'equip. La diferència de potencial que es crea fa que les molècules migrin.

Sembrar la mostra

La manera de sembrar depèn del suport que es fa servir :

• Si són pouets, dipositem una part de la mostra amb l'ajuda d'una micropipeta.
• Altres casos: posar una gota directament en el medi.

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Factors que afecten a la velocitat de migració

Forma i mida de les partícules

Tampó

Temps

Suport

Camp elèctric

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Principals tècniques electroforètiques

Electroforesi en Cellogel

Electroforesi bidimensional

Electroforesi en gel d'agarosa

Electroforesi en camps pulsants (PFGE)

Electroforesi en gel de poliacrilamida (PAGE)

Immunoelectroforesi

Electroenfoc (EEF)

Electroforesi capil·lar

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Electroforesi en Cellogel

L'electroforesi en Cellogel o gel d'acetat de cel·lulosa s'utilitza per realitzar proteïnogrames que és un mètode semiquantitatiu d'anàlisi de les proteïnes plasmàtiques. (També es pot fer amb suports com l'agarosa o l'electroforesi capil·lar)

Lectura

Preparació

Revelat

Electroforesi

informació

informació

informació

informació

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Electroforesi en gel d'agarosa

L'electroforesi en gel d'agarosa o electroforesi d'àcids nucleics s'utilitza per realitzar la separació de fragments d'ADN. (També es pot fer amb gel de poliacrilamida)

Lectura

Preparació

Revelat

Electroforesi

informació

informació

informació

informació

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Electroforesi en gel de poliacrilamida

L'electroforesi en gel de poliacrilamida o PAGE s'utilitza per separar proteïnes. (També per separar fragments petits d'ADN (5-500pb) i la majoria dels RNA.)

PAGE-SDS

Preparació

Tipus

Electroforesi

informació

informació

informació

informació

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Electroenfoc (EEF)

L'electroenfoc és un tipus d'electroforesi en què les proteïnes es separen segons el seu punt isoelèctric (pI) en un gradient continu de pH.

• És necessari un gradient estable de pH, per això, s'utilitzen compostos de baix pes molecular coneguts com a amfòlits portadors amb un pI que va des de 2,5 fins a 11.
• Aquests compostos es fan servir per preparar el gel de poliacrilamida.
• Cada molècula d'amfòlit migrarà cap a un pol o un altre fins que trobi la zona del seu pI. Quan la trobi, queda format un gradient de pH al llarg del gel.
• La EEF aconsegueix separar proteïnes que difereixen en 0.001 unitats de pH, fet que coneixem com a efecte focalitzant.
• El desenvolupament d'aquesta tècnica és més complex perquè es fan servir voltatges variables i elevats (necessitat de refrigeració).
• Una aplicació important és el càlcul del pI de les proteïnes de la mostra.

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Electroforesi bidimensional

L'electroforesi bidimensional és una successió de dues electroforesis diferents realitzades sobre una mateixa mostra.

• Combina dos modes de separació diferents i s'aconsegueix el màxim de resolució possible mitjançant tècniques electroforètiques, és a dir, es procura l'obtenció de substàncies pures.

• Combina:
• Electroenfoc (primera dimensió)
• PAGE-SDS (segona dimensió)
• En acabar la PAGE es pot obtenir informació de les proteïnes si es transfereixen del gel a una membrana (blotting).

• Quan les proteïnes estan a la membrana poden interactuar amb altres molècules, sobretot anticossos (permeten la seva identificació).

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Electroforesi en camps pulsants (PFGE)

L'electroforesi en camps pulsants aconsegueix la separació de grans fragments d'ADN induint la seva reorientació mitjançant canvis periòdics en el camp elèctric.

• La duració dels canvis determina l'interval de mides que es poden separar (com més gran sigui la mida dels fragments, major ha de ser la duració dels camps aplicats).

• Els camps elèctrics de la PFGE estan orientats perpendicularment entre ells, la duració d'aquests camps que s'alternen s'anomena duració del pols.

• Quan apliquem el primer camp: els fragments s'estiren i s'orienten en direcció a aquest camp.

• En aplicar el segon camp: els fragments d'ADN es relaxen i s'alineen d'acord amb aquest segon camp elèctric.
• El temps que tarda el fragment a reorientar-se cap al segon camp depèn de la mida: com major sigui, més temps necessita.

• La repetició d'aquesta seqüència, separa els fragments en funció de la seva mida.
• La duració de cada pols pot anar des de fraccions de segon per a fragments petits d'ADN fins a dues hores per a fragments grans (més de 5Mb).
• La cubeta té un conjunt d'elèctrodes(més de dos) per les diferents orientacions del camp elèctric i la font d'alimentació també és diferent.

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Immunoelectroforesi

L'immunoelectroforesi és una combinació d'electroforesi en gel d'agarosa seguida d'una immunodifusió.

• En l'electroforesi en gel d'agarosa es realitza una aplicació puntual de la mostra, per tant, les diferents proteïnes estaran distribuïdes al llarg del gel segons l'eix de migració.
• Quan s'acaba l'electroforesi no es realitza la tinció.
• Per fer la immunodifusió s'agafa un bisturí de doble fulla i es fa un canal o trinxera sobre el gel que sigui paral·lel a la direcció de migració.
• A continuació es diposita en aquest canal un antisèrum que contengui anticossos específics front una o diverses proteïnes separades en l'electroforesi.
• Els gels es mantenen a temperatura ambient durant 24-48h.
• Els anticossos i les proteïnes (antígens) difonen i es troben formant complex antigen-anticòs que són insolubles i precipiten (formen bandes el·lipsoidals).
• La gran especificitat i sensibilitat de les reaccions de precipitació permet diferenciar substàncies amb mobilitat electroforètica idèntica i detectar components que es trobin en concentracions mínimes (micrograms).

Separació a partir de propietats electroquímiques

Electroforesi

Electroforesi capil·lar

• L'electroforesi capil·lar és una tècnica que utilitza com a suport un capil·lar amb diàmetre intern molt petit (75μm i 25 cm de longitud).
• Dins el capil·lar de separació es troba la dissolució que conté les molècules que es separen i el tampó encarregat de conduir el corrent.

• Entre els dos extrems del capil·lar s'aplica una diferència de potencial d'alt voltatge (500V) que farà que les molècules es moguin cap a un extrem del capil·lar i es separin una de l'altre segons la seva mobilitat electroforètica.

• L'ús d'alt voltatge permet:
• Augment de la resolució
• Temps d'anàlisi més curt
• Consums baixos de mostra i reactius.

• Tècnica molt versàtil perquè es pot utilitzar per a separar qualsevol tipus de compost sempre que s'esculli un detector adient (UV, fluorescència, espectròmetre de masses....)

Separació a partir de la solubilitat

Extraccions amb dissolvents i Cromatografies

Extraccions amb dissolvents

Separació a partir de la solubilitat

Extracció de macromolècules

Les tècniques d'extracció amb dissolvents s'utilitzen per a l'obtenció de macromolècules basant-se en les diferencies en la solubilitat.

Àcids nucleics

Proteïnes

Glúcids

Lípids

extracció

extracció

extracció

Extracció

Separació a partir de la solubilitat

Cromatografies

Les cromatografies són tècniques de separació de mescles per la seva caracterització que es basen en la diferent interacció de les molècules que la formen amb una substància.La seva aplicació consisteix a determinar la identitat i concentració dels components d'una mescla.

Segons el tipus de contacte entre la fase mòbil i l'estacionària.

Segons l'estat de les fases.

Com es fa?

En funció del tipus de fase estacionària que utilitzem trobem la següent classificació.

Segons la interacció de les molècules amb la fase estacionaria.

Centrifugació

Filtració

Decantació

Proteïnes

S'utilitzen tècniques de centrifugació per separarles proteïnes solubles de les proteïnes de membrana. Després es fan servir mètodes com la precipitació salina que aconsegueix la separació de proteïnes concretes a través d'un augment de la força iònica del medi.

• Velocitat alta.
• Capil·lar amb sang total.
• Està en desús.

Microhematocrit

• Accelera la sedimentació de cèl·lules sobre un portaobjectes.
• S'obté una mostra concentrada del líquid d'estudi.
• Pot ser: orina, LCR, líquid sinovial, etc.

Citocentrífuga

• Petita mida
• Velocitat major
• Alguns models tenen refrigeració
• Per volums petits de mostra
• Tubs Eppendorf
• Tècniques de Biologia Molecular

Microcentrífuga

Centrifugació isopícnica

Gradient continu de densitat. La densitat màxima és major que la del component de major densitat de la mostra.Les partícules mai sedimenten en el fons, i es concentren en una banda molt estreta on la densitat del medi és igual a la seva.Temps de centrifugació llarg (1-2 dies)Utracentrifugació (requereix velocitats molt elevades)

Glúcids

S'utilitzen diferents tècniques que permeten eliminar les proteïnes, àcids nucleics i lípids. La majoria acaben amb una cromatografia.

Com es fa:

Es deixa la mostra en repòs un temps. El component de major densitat queda al fons del recipient i el de menor queda a la superfície. La interfase és la línia de separació que queda entre les dues fases. El líquid es recupera amb una pipeta Pasteur.

Font d'alimentació elèctrica

Surten 2 elèctrodes de la font:

• Cable negre: va al pol negatiu
• Cable vermell: va al pol positiu

Els elèctrodes es connecten als dos recipients que té la cubeta d’electroforesi. La font d’alimentació ha d’estar en posició horitzontal i anivellada.

PAGE-SDS

El dodecilsulfat sodic (SDS) és un detergent que s'uneix en una proporció d'una molècula de SDS per cada 2 aminoàcids. Aquesta unió proporciona una càrrega negativa que és proporcional al nombre d'aminoàcids (massa molecular de la proteïna).És l'electroforesi més utilitzada per l'anàlisi de les proteïnes, perquè:

• La gran majoria de proteïnes són solubles en SDS.
• Tots els complexos SDS-proteïna tenen càrrega negativa i migren cap al mateix sentit.
• La densitat de càrrega és molt elevada, per tant, la velocitat de migració també ho és i les electroforesis són molt ràpides.
• La separació depèn d'un paràmetre fisicoquímic com la massa molecular. Normalment, es fan servir marcadors de pes molecular (per a poder calcular el pes molecular de les proteïnes de la mostra).
• Els complexos SDS-proteïna es tenyeixen fàcilment.

• A partir de 50.000 rpm
• Sistemes auxiliars: refrigeració i buit.
• Ús en laboratoris mèdics i biològics molt especialitzats.
• Separen estructures subcel·lulars:
• Lisosomes
• Ribosomes
• Mitocondris

Ultracentrífuga

• 18.000-25.000 rpm
• Està refigerada per evitar que s'escalfin les mostres.
• Algunes tenen sistema de buit (per mostres sensibles al contacte amb l'oxigen).
• Útil per separar suspensions de partícules molt petites com a biologia molecular.

D'alta velocitat

• Petita mida
• 4.000-15.000 rpm
• No té sistema de refrigeració
• Útil per separar suspensions amb partícules grans.

De baixa velocitat o de sobretaula:

Preparació

El suport està compost per acrilamida i bisacrilamida.La mida dels porus pot variar perquè:

• La concentració d'acrilamida proporciona al suport entramats més o menys densos.
• La concentració de bisacrilamida condiciona el grau d'entrecreuament de cadenes.

Atenció

Gel

Electroforesi

1. Col·loquem el tampó en la cubeta i hi submergim el gel d'agarosa (el tampó cobreix tot el gel = electroforesi submarina). Es dissipa millor la calor.
2. Retirem la pinta.
3. Omplim els pouets (5μl posats amb l'ajuda de micropipetes) amb la mostra ADN en dissolució. La mostra cau per gravetat dins el pouet.
4. Carreguem un o dos pouets dels extrems ambmarcadors de pes molecular.

5. Tapem i connectem a la font d'alimentació. Ajustem intensitat i temps. (5V per cada centímetre de separació dels elèctrodes).6. L'electroforesi acaba quant s'ha produït la màxima separació dels components de la mostra. Els marcadors ens ho indicaran.

Temps d'electroforesi

A major temps d'electroforesi, major separació de les molècules que migren a diferents velocitats.El temps s'ha de combinar amb:

• Voltatge
• Mida del suport

Força centrífuga relativa

FCR= k · (rpm)2 · r= Xg On: FCR: força centrífuga relativa k= 1,12 · 10-5 r: radi en cm entre l'eix de la centrífuga i el centre del tub a centrifugar. rpm: revolucions (voltes) per minut de la centrífuga. Xg: nombre de vegades la força de gravetat (981 cm/s2)

La separació depèn de la càrrega elèctrica i de la mida de la molècula perquè els porus del suport fan la funció de tamís. Poden ser:

• Gel agarosa: per a separar proteïnes i àcids nucleics. La mida del porus depèn de la concentració d'agarosa: major concentració d'agarosa = menor diàmetre del porus.
• Gel de poliacrilamida (PAGE): la mida de porus és menor que els del gel d'agarosa. S'usa per separar molècules més petites. La mida del porus depèn de la concentració del gel.
• Gel de midó: difícil de preparar (s'usa poc).

Restrictius

La separació es fa en funció de la càrrega elèctrica perquè tenen una gran mida de porus. Poden ser:

• Acetat de cel·lulosa: la més habitual per a proteïnogrames (separació de proteïnes plasmàtiques)
• De paper: en desús.

No restrictius

Centrifugació zonal

Es fa servir un gradient preformat que pot ser continu o discontinu (la densitat màxima és menor que la del component de major densitat de la mostra).La mostra es posa a la part superior del gradient i es centrifuga.La centrifugació s’atura abans de que s’arribi a l’equilibri: evitem que les partícules més pesades es dipositin al fons i s’ajuntin diferents bandes.Es separen per bandes discretes.Es pot recollir cada banda per aspiració.

Camp elèctric

És el gradient de potencial que mobilitza les molècules carregades.Factors del camp elèctric que influeixen en l'electroforesi:

• Diferència de potencial, intensitat de corrent i resistència.
• Efecte Joule: el pas de corrent elèctric produeix calor. En augmentar la temperatura les proteïnes es desnaturalitzen i el tampó s'evapora = augmenta la força iònica = no hi ha una bona separació. L'efecte Joule és major si la diferència entre el potencial i la resistència del sistema és major.

Per solucionar aquest fet, les electroforesis d'alt voltatge han detenir un bon sistema de refrigeració.

Àcids nucleics

Extracció d'ADN a partir de sang perifèrica.

• Afegim una solució de lisis que degrada les proteïnes i l'ARN.

• Centrifuguem i retirem el precipitat (que consisteix en les restes de la degradació anterior): obtenim una fase aquosa on hi ha l'ADN genòmic.

• Afegim etanol perquè l'ADN és insoluble i precipita.
• Centrifuguem i aconseguim el precipitat que serà ADN de gran puresa.

Lípids

Procediment de Folch (mescla de cloroform i metanol). Els lípids es dissolen amb cloroform i després s’elimina el cloroform per evaporació i es recuperen els lípids.

Filtres de paper

• Filtre llis o alemany: S'utilitza quan interessa conservar el sòlid retingut.

• Filtre de plecs o francès: s'utilitza quan es vol conservar el líquid filtrat. Filtra amb més rapidesa ja que té més superfície de filtrat.

Diferents formes, mides i diàmetres de porus, en funció de les característiques i volum del líquid que volem filtrar. Molt utilitzats perquè són barats i es poden esterilitzar. Inconvenient: Poden cedir fibres al filtrat. S'utilitzen amb un embut (normalment de vidre).

Preparativa diferencial

La més usadaSedimentació de cèl·lules en sang i orina.Procediment:

• Es centrifuga la mostra a baixa velocitat i es recull el sobrenedant.

• Es centrifuga el sobrenedant a velocitat mitja, es recull el sobrenedant

• Es centrifuga el sobrenedant a velocitat alta.

Obtenim 3 precipitats i 1 sobrenedant amb diferents densitats: substàncies diferents.

Extracció amb dissolvents

Cromatografies

S'utilitza quan ens interessa recuperar el sòlid d'una filtració.

Quan s'ha fet l'operació, es neteja el sòlid que queda sobre el material filtrant, afegint aigua o un altra dissolvent.

Preparativa en gradient de densitat

El gradient de densitat pot ser de dos tipus:

• Preformat:

Es prepara abans de centrifugar.Pot ser:

• Discontinu o escalonat : Es dipositen capes successives de dissolució en concentracions decreixents: 25%,20%,15%,10%...

El més concentrat serà el del 25% i damunt hi haurà el del 15%...

• Continu: Es prepararen dos dissolucions amb diferents concentracions(exemple 5% i 30%) i es col·loquen en un dispositiu formador de gradients.

Es crea un gradient continu que va des de la concentració més alta a la més baixa.

• Autoformat:
• El gradient es crea mitjançant la centrifugació, al mateix temps que es fracciona la mostra.
• Serà un gradient continu.

La mostra es diposita dins un fluïd amb un gradient de densitat: aquest gradient és un solut de baixa massa molecular.Aquest solut sol ser:

• Sacarosa
• Polisacàrids sintètics: Ficoll i Percoll
• Sals de metalls alcalins: clorur de Cesi

Al centrifugar-la, les partícules es distribueixen en fraccions de diferents densitats.A major concentració = més densitatLa separació dels components es presenta en bandes o zones que poden ser separades amb una pipeta.El gradient evita la mescla dels components de la mostra.

Preparació

Treure els àcids nucleics del nucli de la cèl·lula i tallar-los amb l'ajuda d'enzims de restricció.Amplificar aquests fragments amb una PCR (reacció en cadena de la polimerasa) Preparar una dissolució amb la mostra en el mateix tampó que utilitzarem posteriorment

• Incorporar 40% sacarosa (p/v), glicerol (30% p/v) o Ficoll (15% p/v) per poder incrementar la seva densitat i facilitar la sembra.

Gel

Solució tampó

Substància reveladora

Marcador de pes molecular

Cubeta

Es recomana que les cubetes siguin de petita mida perquè:

• Tenen menys superfície d'evaporació
• Hi ha menys diferència de temperatura entre elles
• Permet una reducció de la mida de les aplicacions.

• 2 recipients: on posar la solució tampó. La funció d'aquest tampó és evitar que l'ànode es torni àcid i el càtode bàsic, per culpa de l'electròlisi de l'aigua causada pel camp elèctric.
• Un pont: on es col·loca el suport. Els recipients duen connectats els elèctrodes: es crea un diferencial de potencial entre els dos.

Les cubetes han d'estar netes, seques i tapades quan no s'utilitzen.

Preparativa

Separació dels components de la mescla.Grans volumsS’usa a laboratoris clínicsEns permet preparar la mostra: fase preanalíticaDos tipus de centrifugacions preparativa:

• Preparativa diferencial
• Preparativa en gradient de densitat

Preparació

Partim d'una mostra de sèrum obtinguda de la sang i centrifugada.Les tires d'acetat de cel·lulosa s'obtenen fent reaccionar la cel·lulosa amb l'àcid acètic.

• Habitualment s'utilitzen tires comercials Cellogel: es submergeixen 10 minuts amb el tampó perquè s'omplin els porus abans d'utilitzar-ho. Quan es treuen del tampó s'assequen amb paper de filtre.

Solució tampó

Colorant

Solució decolorant

Solució transparentitzadora

Lectura

Informe: percentatge de cada fracció respecte a la concentració total.2 formes de fer la lectura:

• Espectrofotometria:
• Retallar les diferents franges i introduir-les en tubs amb un dissolvent: treu les proteïnes del Cellogel = Obtenim una dissolució per cada franja.
• Mesurem l'absorbància de cada dissolució i la comparem amb l'absorbància obtinguda pel total de proteïnes.
• Densiometria:
• Un fotòmetre quantifica el colorant fixat a cada una de les franges.
• Aquesta quantificació queda representada mitjançant un proteïnograma i ens diu les fraccions de cada component en relació amb les proteïnes totals obtingudes prèviament.
• S'ha d'aconseguir un fons totalment transparent.

Segons la interacció de les molècules amb la fase estacionària.

• D'adsorció
• De repartiment
• D'intercanvi iònic
• De penetrabilitat
• D'afinitat

Coeficient de sedimentació

Per calcular el coeficient d'una partícula o macromolècula hem de dividir la seva velocitat de sedimentació (en m/s) per l'acceleració aplicada en (m/s2). El resultat s'expressa en unitats de temps: Svedbergs (1S= 10-13 segons). Quan fem una centrifugació totes les mostres reben la mateixa acceleració. La resposta de cada mostra és diferent a causa de la massa de la partícula i la seva forma i mida.

Segons l'estat de les fases.

• Líquids: HPLC (cromatografia líquida d'alta eficàcia)
• Gasos: gas-líquid o gas-sòlid
• Fluids supercrítics

Cromatografies

Consisteix a col·locar la mostra sobre un suport (fase estacionària) i submergir-la en un dissolvent (fase mòbil). Els components de la mostra migraran pel suport segons la seva afinitat per la fase mòbil o per la fase estacionària. S'obté una separació visible sobre el suport.

• Per grans volums de mostra
• El precipitat queda al fons i al lateral del tub.

Angular o d'angle fixe

• Tubs en vertical dins el rotor en forma de cilindre
• Per grans volums de mostra
• Centrifugacions ràpides
• Precipitat al lateral del tub més allunyat de l'eix del rotor.

Vertical

• Quan gira els tubs es col·loquen a una posició de 90º amb l'eix.
• Per volums petits de mostra
• La separació depèn de l'alçada del tub.

Flotant o basculant

Fem una filtració prèvia amb un altre tipus de filtre per a retirar partícules majors abans de procedir amb el filtre de membrana.

Revelat

1. Retirem la tira de la cubeta i la deixem 10 minuts submergida en el colorant.
2. Decolorem la tira passant-la per 3 o 4 palanganes plenes de líquid decolorant fins observar les bandes i un fons clar.
3. Passem la tira per una palangana amb la solució transparentitzadora
4. Eliminem els excessos de decolorant i eixuguem la tira posant-la entre papers de filtre.

Electroforesi

Una modalitat de la PAGE vertical és la realitzada amb gels en gradient: la concentració d'acrilamida augmenta progressivament des de la part superior del gel fins a la inferior = les bandes es van fent més estretes i millora la resolució. A la mostra hi posem glicerol per a augmentar la seva densitat i a la solució tampó s'afegeixen un o diversos marcadors electroforètics com el blau de bromofenol.

Tipus principals de PAGE

1. Page en condicions no desnaturalitzants.

Condicions en què no s'altera la conformació nativa de les proteïnes separades, per tant, es poden continuar fent estudis de funcionalitat d'aquestes.Es pot carregar la mostra directament en el gel en el qual es produirà la separació: la concentració del gel és uniforme i hi ha un únic tampó. Es poden utilitzar dos tampons. Un pels reservoris i un altre per cobrir el gel.

1. PAGE en condicions desnaturalitzants

En presència d'alguns agents (composts químics) les proteïnes perden la seva estructura nativa, desplegant-se, aquests poden ser: β-mercaptoetanol, ditiotreitol, urea, detergents... Els components s'afegeixen al tampó de la mostra i tots els components utilitzats per preparar el gel. Un exemple de PAGE en condicions desnaturalitzants és la PAGE-SDS.

Tampó

Fonamental pel manteniment del pH constant.Funcions del tampó:

• Pal·lia els efectes de l'electròlisi que es produeix per l'acció del camp elèctric.
• Manté una força iònica adequada. Aquesta força depèn de la concentració d'ions i condiciona la mobilitat electroforètica dels components de la mostra.
• Ha de ser prou gran per a mantenir el pH i la conductivitat durant tot el procés, però no molt elevada perquè interferiria amb el sistema i faria disminuir la velocitat de migració de la mostra.
• Habitualment els tampons que s'usen tenen forces moderades: 0,05-0,10M
• Manté una càrrega neta constant en les molècules a separar. El grau d'ionització depèn del pH del medi. Aquest grau s'ha de mantenir constant o produirà un canvi en la migració de les molècules.

Els tampons es poden reutilitzar.

Forma

Major mida = més fricció = menys velocitat de migració.

Mida

Esfèrica = migren a major velocitat que les irregulars perquè l'esfera presenta menor superfície i igual volum.

Aconseguim que molècules de la mateixa mida i càrrega, però diferent forma, puguin separar-se per electroforesi.

Revelat

1. Retirem la tira de la cubeta.
2. Afegim bromur d'etidi (emet llum).

Electroforesi

1. Sembrem la mostra en el costat del càtode amb l'ajuda d'un aplicador (tros de metall que transporta una petita quantitat de mostra)
1. Els aplicadors poden ser: macro, semimicro i micro (en funció del volum de mostra).
2. Introduïm el pont en la cubeta de forma que hi hagi contacte entre el Cellogel i el tampó.

3. Tapem i connectem a la font d'alimentació. Ajustem la intensitat del corrent i el temps. Per exemple: intensitat de 0,1A durant 35 mins a 200V.

La densitat és una propietat característica de les diferents substàncies i composts.

En una mescla heterogènia cada fase té la seva pròpia densitat.

Lectura

• S'introdueix el gel en un transil·luminador de llum ultravioleta.
• És necessari fer fotografies al gel per conservar el resultat.
• El transil·luminador té una càmera que ens permet fer una foto quan el gel està sota la llum.
• Es sap la mida de cada banda d'ADN comparant-lo amb els del control de pes molecular.

Si el porus és gran, netejar passant aigua o el dissolvent utilitzat en el liquid que s'ha filtrat però en sentit contrari al de la filtració. Si el porus és petit, submergir placa en dissolvents adequats o en àcid sulfúric calent.

Filtres de vidre molt o plaques filtrants

Plaques constituides per pols de vidre molt, tamisat i aglomerat amb gran resistència química que van montades en un crisol o embut filtrant. Presenten numeració referida al diàmetre mitjà dels porus , que pot oscilar entre 2 i 200 µm. Les plaques permeten fer moltes filtracions sempre i quan es faci una bona neteja després.

Filtres de membrana

S'empren per realitzar filtracions esterilitzants. Tenen forma de disc i estan composts d'acetat o nitrat de cel·lulosa. Existeixen filtres amb diferent tamany de porus.

Lorem ipsum dolor

Consectetur adipiscing elit

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod.

• Lorem ipsum dolor sit amet.
• Consectetur adipiscing elit.
• Sed do eiusmod tempor incididunt ut.

Lorem ipsum dolor sit

Suport

• La presència del suport fa que es presentin tres fenòmens que retenen la migració:
• Adsorció: retenció inespecífica de les molècules de la mostra sobre el suport.
• Electroendosmosi (EEO): sobretot en suports no restrictius, on apareixen càrregues negatives per estar en contacte amb una dissolució iònica. Aquestes càrregues fan que la mateixa solució migri en el camp elèctric:
• Flux de cations sobre la superfície del suport.
• Flux d'anions sobre el centre dels porus.
• Aquest flux interfereix en la migració dels components de la mescla.
• Entapissat (tamizado) molecular: efecte a causa del diàmetre dels porus dels suports. El suport separa les molècules en funció de la seva mida.

Electroforesi

Segons el tipus de contacte entre la fase mòbil i l'estacionària.

• Plana, en paper o en capa fina.
• En columna.

Analítica

No s’usa al laboratori clínic.Mesurar les propietats físques de les partícules que sedimenten: coeficient de sedimentació, massa molecular.Es parteix d’un volum petit de mostra (lo més pura possible) i es centrifuga ultracentrifugació.Durant la ultracentrifugació s’observen les molècules amb un sistema òptic: els tubs de la centrífuga són de quars que deixen passar la llum visible i la ultravioleta.

Aplicacions:

• Puresa del compost
• Proporció relativa dels components
• Estructura molecular dels compostos