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Técnicas de manipulação de dna

Webgrafia

Webgrafia: - https://pt.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/v/applications-of-dna-technologies file:///C:/Users/utilizador/Downloads/MSc_Ana_J_Fernandes.pdf

Clonagem

Ovelha Dolly ( 1º mamífero a ser clonado )

Processo de fazer várias cópias idênticas de um determinado pedaço de DNA. Num procedimento típico de clonagem de DNA, o gene ou outro fragmento de DNA de interesse é primeiramente inserido numa peça circular de DNA chamada plasmídeo. A inserção é feita utilizando enzimas que “cortam e colam” DNA, produzindo uma molécula de DNA recombinante, ou seja, DNA montado a partir de fragmentos de várias fontes.

Qual a finalidade de produzir várias destas cópias na clonagem? Em alguns casos, para realizar experimentos ou construir novos plasmídeos. Em outros, o pedaço de DNA codifica uma proteína útil, e as bactérias são usadas como "fábricas" para produção dessa proteína.

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Corte e colagem do DNA

Uso dois tipos de enzimas: enzimas de restrição (uma enzima cortadora de DNA que reconhece uma sequência alvo específica e corta o DNA em dois pedaços neste sítio ou próximo a ele ) e DNA ligase. Se duas moléculas tiverem saliências correspondentes, elas permanecem juntas. Contudo, elas não irão combinar-se para formar uma molécula de DNA intacta até que sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas do eixo do DNA. A meta na clonagem é inserir um gene alvo num plasmídeo.Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer um plasmídeo recombinante contendo o gene.

Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, num processo chamado transformação. Durante a transformação, é dado um choque (por exposição a alta temperatura) a células bacterianas especialmente preparadas que as encorajam a incorporar DNA estranho. Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo.

Transformação e seleção bacteriana

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Produção de proteína

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Uma vez que encontramos uma colónia de bactérias com o plasmídeo certo, podemos cultivar uma grande cultura de bactérias portadoras do plasmídeo. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo. As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades de proteína.

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Reação em cadeia da polimerase

PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao invés de um organismo).

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada.

Taq polimerase- Assim como a replicação de DNA num organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus)

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Primers de PCR- Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Nesta reação, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que escolher. Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples. Dois primers são usados para cada reação de PCR. Isto é, são dadas sequências que os farão ligações a fitas opostas do DNA molde, nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam a moldes bases complementares.

Desnaturação (96ºC) - Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.

Anelamento (55ºC-60ªC)- Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.

Extensão (72ºC): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.

Eletroforese

Técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão mover-se através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras.

Contexto da palavra gel- placa de material gelatinoso. Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos de um polissacarídeo chamado agarose. Quando a agarose é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e deixada para arrefecer, uma matriz de moléculas de agarose que são mantidas unidas por ligações de hidrogênio.

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Antes das amostras de DNA serem adicionadas, o gel deve ser colocado numa caixa de gel. Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. O corpo principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução tampão contendo sal que pode conduzir corrente.

A extremidade do gel com os poços está voltada para o eletrodo negativo. A extremidade sem poços (para a qual os fragmentos de DNA vão migrar) está voltada para o eletrodo positivo.

Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que queremos examinar é cuidadosamente transferida para um dos poços. Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. As escadas de DNA comerciais vêm em diferentes intervalos de tamanho, então podemos escolher uma que tenha boa "cobertura" para a faixa de tamanho esperada dos fragmentos.

A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm carga negativa, assim elas começam mover através da matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente passa através do gel.

Qual fragmento de DNA vai ganhar a "corrida" para o polo positivo? Após o gel ter corrido por algum tempo, os pedaços mais curtos de DNA vão estar mais próximos do polo positivo do gel, enquanto os mais longos vão permanecer próximos aos poços. Pedaços muitos curtos de DNA podem correr diretamente para a extremidade do gel se forem deixados por períodos suficientemente longos.

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Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar o gel e ver quais tamanhos de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.

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DNA Recombinante

O DNA recombinante (rDNA) é uma forma de DNA artificial criada por combinação de duas ou mais sequências que naturalmente não ocorreriam juntas. Podem ser uma mistura de DNA proveniente de indivíduos de espécies diferentes ou até mesmo de reinos diferentes. Existem três métodos diferentes para obter rDNA: -transformação, -introdução por fagos -transformação não bacteriana. O rDNA funciona quando a célula hospedeira expressa uma proteína codificada pelos genes recombinantes. A síntese de proteínas recombinantes é induzida por fatores de expressão que fornecem instruções para que os genes sejam transcritos e traduzidos pela célula.

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Sequenciamento do DNA

Processo de determinação da sequência de nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.

Sequenciamento de Sanger: o método de terminação da cadeiaRegiões de DNA com baixos números de pares de base ( 900 - ) o método Sanger é amplamente usado para o sequenciamento de fragmentos individuais de DNA, como fragmentos usados na Clonagem de DNA ou gerados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).Ingredientes:

• Uma enzima DNA polimerase
• Um primer
• Os quatro nucleotídeos do DNA
• O DNA molde a ser sequenciado
• Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro nucleotídeos, cada uma marcada com um corante de uma cor diferente

Limitações - O método Sanger de sequenciamento é caro e ineficiente para projetos de larga escala, como o sequenciamento de um genoma inteiro. Para tarefas como essa, novas técnicas de sequenciamento de larga escala são mais rápidas e menos caras.

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Etapas do sequenciamento do DNA

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A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada num tubo com primer, DNA polimerase e nucleotídeos de DNA . Os quatro nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com corantes são adicionados também, mas em concentração muito menor que a dos nucleotídeos comuns.

A mistura é primeiro aquecida para a denaturação do DNA molde (separar as fitas), então arrefecida para que os primers possam ligar-se ao molde da fita simples

Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é aumentada novamente, permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até que aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal.

Nesse ponto, os nucleotídeos não podem ser adicionados, e portanto a fita terminará em um dideoxinucleotídeo. Este processo é repetido várias vezes.

Quando o ciclo se completa, é praticamente garantido que um dideóxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do DNA alvo. Ou seja, o tubo irá conter fragmentos de diferentes comprimentos, terminando em cada uma das posições de nucleotídeos no DNA original.

As extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que indicam o nucleotídeo final.

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benefícios e Maléficios Criminologia, Agricultura e Medicina

medicina

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Criminologia

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Agricultura

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Malefícios:1. Riscos para a Saúde: Existem preocupações sobre os potenciais efeitos adversos para a saúde humana associados ao consumo de alimentos geneticamente modificados e à exposição a organismos geneticamente modificados. 2. Ética e Consentimento: O uso de OGMs na medicina levanta questões éticas sobre consentimento informado, especialmente quando envolve terapia genética e manipulação genética embrionária. 3. Desigualdade de Acesso: A disponibilidade e acessibilidade de tratamentos baseados em OGMs podem criar disparidades no acesso aos cuidados de saúde, favorecendo grupos socioeconômicos mais privilegiados.

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• 1. Identificação Forense: O uso de OGMs na criminologia pode melhorar as técnicas de identificação forense, fornecendo evidências mais precisas e conclusivas em investigações criminais.
• 2. Perfil Genético: Os OGMs podem ser utilizados para desenvolver perfis genéticos de suspeitos e vítimas, auxiliando na investigação e resolução de crimes.
• 3. Prevenção de Crimes:Ao identificar padrões genéticos associados a comportamentos criminosos, os OGMs podem ajudar na prevenção de crimes e no desenvolvimento de estratégias de intervenção precoce.

Benefícios

1. Aumento da Produtividade: Os OGMs podem ser projetados para resistir a pragas, doenças e condições climáticas adversas, aumentando assim o rendimento das culturas e contribuindo para a segurança alimentar global. 2. Redução do Uso de Pesticidas: Culturas geneticamente modificadas podem exigir menos pesticidas e herbicidas, reduzindo a exposição dos agricultores a produtos químicos e minimizando a poluição ambiental. 3. Melhoria da Qualidade dos Alimentos: Alguns OGMs são desenvolvidos para aumentar o teor de nutrientes ou melhorar outras características de qualidade dos alimentos, como sabor e tempo de prateleira.

Benefícios

• Biotecnologia é o uso de um organismo, componente de um organismo ou qualquer outro sistema biológico para fazer um produto ou processo para um uso específico.
• Muitos exemplos da biotecnologia moderna dependem da capacidade de analisar, manipular, cortar e colar pedaços do DNA. Ocasionalmente, as manobras manipulação de DNA são designadas por tecnologia do DNA

Biotecnologia e tecnologia do DNA

• Clonagem
• Sequenciamneto do DNA
• DNA Recombinante
• Eletroforese

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• 1. **Terapia Genética:** Os OGMs podem ser usados para desenvolver terapias genéticas inovadoras para tratar doenças genéticas e distúrbios hereditários.
• 2. **Produção de Medicamentos:** Alguns OGMs são utilizados na produção de medicamentos biotecnológicos, como insulina e vacinas, permitindo tratamentos mais eficazes e acessíveis.
• 3. **Pesquisa Médica:** Os OGMs são uma ferramenta valiosa para a pesquisa médica, permitindo o estudo de processos biológicos complexos e o desenvolvimento de novos tratamentos e terapias.

Benefícios

Malefícios

1. Privacidade e Consentimento: A coleta e análise de material genético para fins criminais levantam preocupações sobre privacidade e consentimento informado, especialmente quando envolvem indivíduos inocentes ou grupos marginalizados. 2. Estigmatização: O uso de informações genéticas na criminologia pode levar à estigmatização de certos grupos populacionais associados a perfis genéticos específicos, aumentando o risco de discriminação e marginalização. 3. Potencial para Abuso: A utilização indevida ou não autorizada de OGMs na criminologia pode resultar em abusos de poder, violações de direitos humanos e injustiças judiciais.

• Ocasionalmente, há algum “erro tipográfico” ( que pode ser uma alteração, uma falha ou uma duplicação) na sequência de DNA de um gene (mutação defeituosa).
• Por vezes, o erro leva a que nenhuma proteína seja produzida.
• Mas nem todas as alterações no DNA são prejudiciais. Algumas mutações não têm qualquer efeito e outras levam à produção de novas versões de proteínas que conferem uma vantagem na sobrevivência dos organismos que as possuem.
• Ao longo do tempo, as mutações são o material a partir do qual novas formas de vida evoluem.

Mutações

-Transportam as nossas características de geração em geração -Feitos de ácido desoxirribonucleico -DNA-Livro de instruções para as funcionalidades das moléculas como o RNA e as proteínas (não se conseguem copiar a si próprias )-Constituintes deste : Adenina, Guanina, Timina e Citosina

"Arquitetura do corpo"

Genes

Malefícios:

1. Impactos Ambientais: O cultivo de OGMs pode ter impactos ambientais negativos, como a contaminação genética de espécies selvagens e a perda de biodiversidade. 2. Resistência de Pragas e Ervas Daninhas: O uso extensivo de culturas geneticamente modificadas pode levar ao desenvolvimento de resistência em pragas e ervas daninhas, exigindo o uso de métodos de controle mais agressivos e contribuindo para o aumento da resistência. 3. Concentração de Poder: O desenvolvimento e comercialização de OGMs podem resultar na concentração de poder e recursos nas mãos de grandes empresas de biotecnologia, prejudicando pequenos agricultores e a diversidade agrícola.