Principales técnicas histoenzimáticas

Principales técnicas histoenzimáticas

PROCESO DE TINCIÓN

Acetilcolinesterasa

Deshidrogenasa succinica

NADH

Fosfatasa ácida y alcalina

ATPasa

Fosforilasa

Citocromo c oxidasa

Fosfatasa alcalina

Fosfatasa ácida

La acetilcolinesterasa en un grupo de enzimas que actúan descomponiendo la acetilcolina, un molécula que es utilizada por las células nerviosas para transmitir estímulos nerviosos.

Objetivo

El complejo IV o citocromo c oxidasa es el complejo final de la cadena respiratoria, el cual cataliza la oxidación del citocromo c transfiriendo sus electrones al oxígeno.

Fundamento

Se utiliza la catalasa para desdoblar las moléculas de peróxido de hidrógeno generadas en la acción de la citocromo oxidada sobre el citocromo C. El oxígeno liberado oxida la diamonobencidina hasta su forma pigmentada soluble. El resultado se refleja en la actividad citocromooxidasa de color parduzco

Tinción de la ATPasa

Objetivo

Es una coenzima que funciona como un catalizador que provoca cambios químicos en otras sustancias. Produce el intercambio de electrones e hidrogeniones en la producción de energía de todas las células. El NADH trasnfiere sus electrones a la coenzima Q, generando NAD+ en el proceso.

Fundamento

Transporta hidrógeno desde el sustrato propio de la succinicodeshidrogenasa hasta los aceptores (citocromooxidasa). Reduce las sales de tetrazolio a formazanes coloreados tras su quelacion con sales de cobalto. Resultado: Fibras musculares de color negro.

Objetivo

Se trata de una enzima que transfiere hidrógeno desde un sustrato a un aceptor específico. El ácido succínico está presente en el ciclo de krebs. Mecanismo aerobio fundamental para obtención de energía.

Fundamento

Se libera hidrógeno por el sustrato sódico. Los H liberados reducen sales de tetrazolio formando sustancias no coloreadas hasta azul de formazán que, es quelado con iones de cobalto y forma un depósito soluble de color negro. Se utilizan para el diagnóstico post-mortem de infarto de miocardio.

Fosfatasa ácida y alcalina

Objetivo

Las fosfatasas son un grupo de enzimas hidrolíticos que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico. Algunas fosfatasas actúan específicamente sobre un sustrato determinado, pero la mayoría actúan sobre diversos sustratos y su clasificación se basa en el pH al cual presentan una actividad óptima

Fundamento

Se utiliza como sustrato el naftol-AS-BI-fosfato. El naftol liberado se demuestra con una sal de diazonio: pararrosanilina con nitrito sódico para la fosfatasa ácida (se tiñen de color rojo-anaranjado) y Fast Red TR para la fosfatasa alcalina (color rojo). Tras la reacción, los núcleos se contrastan con hematoxilina. En el caso de la fosfatasa ácida, los cortes se deshidratan, se aclaran y se montan con Entellán o DPX. En el caso de la fosfatasa alcalina no es posible la deshidratación (se montan con glicerina).

Tinción con NADH

Objetivo

Son enzimas cuya función es demostrar la musculatura esquelética de los mamíferos, definiendo a las fibras rojas como fibras de alta actividad oxidativa y de baja actividad mATPasa miosínica. Las fibras del músculo rosa presentan características intermedias con respecto a las del músculo rojo y blanco.

Fundamento

Se congelan las muestras en 2-metil-butano, se cortan en criostato a -20ºC (grosor 8-12 micras). Se someten las secciones obtenidas a la detección de enzimas oxidativos y de ATPasa miosínica. Se realiza una preincubación ácida (1min) y una preincubación alcalina (7min). Tras estas incubaciones, se incuban las secciones (20-22ºC/1h) tras preincubación ácida y 30 min tras la alcalina, en lamisma solución de la alcalina pero añadiendo 1,5mgr de Na2ATP por ml de solución y ajustando el pH a 9,4

Objetivo

Las fosforilasas son enzimas que catalizan la adición de un grupo fosfato a partir de un fosfato inorgánico a un aceptor.

Fundamento

Cataliza la fosforólisis de los enlaces alfa-1,4-glucosídicos que unen a los monómeros de glucosa en el glucógeno, dando como resultado la producción de glucosa 1-fosfato, que puede convertirse en glucosa 6-fosfato.

Objetivo

La colinesterasa es una enzima para la transmisión nerviosa en las uniones neuromusculares. La colinesterasa hidroliza la acetilcolina en ácido acético y colina, poniendo fin a la transmisión nerviosa colinesterasa.

Fundamento

Se produce una hidrólisis rápida del neurotransmisor Ach en las sinapsis colinérgicas. La reacción de hidrólisis procede al grupo carbonilo, acilación de la enzima y liberación de Ch. Posteriormente, se hidroliza la enzima acilada dando ácido acético.

Fundamentos de las técnicas enzimohistoquímicas

Se pueden marcar las reacciones de las enzimas ya que tienen capacidad de mantener su centro activo funcionando tras la fijación tisular. La enzima en contacto con el sustrato, lo transforma y recibe el nombre Producto primario de la reacción. Si este producto es coloreado en vez de ser opaco como consecuencia de otra reacción con un cromóforo u otra sustancia que aporte ese color se obtendrá el Producto final de la reacción.

¿Cómo se ve el resultado?

• Opaco, coloreado e insoluble, pudiéndose verse al microscopio: método de captura simultánea.
• no ser opaco, incoloro y soluble, no se vería al microscopio y habría que añadirle otra sustancia o cromóforo: reactivo de captura. Bajo la acción de este reactivo la enzima daría lugar al producto final de reacción (PFR), este es el método post copulativo.
• Luminiscencia, fluorescencia y fosforescencia.
• Incremento del índice refractivo.

Tinción con deshidrogenasa succínica

Protocolo

1. Los extendidos sanguíneos deben estar fijados y secos.
2. Realizar una dilución 6mL del buffer con 54 mL de agua destilada.
3. Adicionar el reactivo disuelto y mezclar.
4. Mezclar pararosanilina y nitrito de sodio, dejando reaccionar 1 minuto y enseguida vaciarlo a la cubeta de tinción , y mezclar las disoluciones.
5. Sumergir el extendido en esta mezcla (60 minutos)
6. Teñir con verde metilo (1 min).
7. Enjuague con agua destilada
8. Dejar secar las placas.
9. Realizar montaje con medio acuoso.