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Presentación Southern Blot
Julia Becerra Morales
Created on February 22, 2024
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Transcript
Southern Blot
Técnica de hibridación de biología molecular
África Benítez, María Romero y Julia Becerra
Índice
5. Protocolo
1. Introducción
2. Sonda utilizada
6. Aplicaciones
3. Tipo muestra
7. Conclusión
4. Materiales
Introducción
La hibridación es la unión de 2 moléculas monocatenarias por complementariedad de sus bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria. El Southern Blot es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN purificado separados por electroforesis y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nylon. A diferencia del Dot Blot, permite la detección simultánea de varias secuencias diana.
SONDA UTILIZADA
Sonda radiactiva
La sondas radiactivas son las más utilizadas, aunque pueden emplearse otros tipos de marcaje.
tipo de muestra
MUESTRAS DE ADN
El Southern Blot se utiliza para el estudio de ADN. Concretamente ADN purificado de muestras biológicas como son la sangre y los tejidos
materiales
materiales
Electroforesis en gel de agarosa
Solución salina fosfato
Enzimas de restricción
Tampón con ph neutro
Reactivos
EDTA
Protocolo
PROTOCOLO
1. Digestión enzimática
2. Electroforesis en gel
3. Desnaturalización del ADN en el gel
4. Transferencia del ADN desde el gel a la membrana
5. Prehibridación
6. Hibridación
7. Revelado
APLICACIONES
PRINCIPALES APLICACIONES
El Southern Blot tiene múltiples aplicaciones, aunque muchas de ellas están siendo sustituidas por técnicas como la PCR.
- Estudio de mutaciones estructurales como traslocaciones, deleciones, inserciones o inversiones.
- Detección de secuencias adquiridas.
PRINCIPALES APLICACIONES
- Elaboración de huellas genéticas para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN, explorando la repetición de secuencias altamente variables (microsatélites).
CONCLUSIÓN
Por último, esta técnica es ampliamente utilizada en el laboratorio con fines diagnósticos, por lo que resulta muy útil.
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Como el Dot Blot, se incuba la membrana con los distintos reactivos dentro de una bolsa con cierre hermético o acoplada a la pared interna de un tubo de hibridación. Todas las incubaciones se realizan a la temperatura adecuada y en agitación. La hibridación se realiza con las sondas específicas, marcadas y diluidas en una solución de hibridación adecuada. Si se usan varias sondas, sus Tm deben ser similares para que sus cinéticas de hibridación sean parecidas. Una vez formados los híbridos sonda/secuencia diana, se realizan 2 o más lavados de poshibridación.
Transferencia por capilaridad. Para ello hay que montar un dispositivo que consta de: - cubeta con buffer de transferencia - soporte plástico o esponja - papel Whatman humedecido con buffer - gel boca abajo - 3 hojas de papel Whatman (filtro) - papeles absorbentes apilados - un peso ligero Este dispositivo se mantiene toda la noche para que los fragmentos de ADN pasen a la membrana. La transferencia se puede acelerar aplicando un campo eléctrico o vacío. Para terminar de anclar el ADN, se incuba la membrana a 80ºC si es de nitrocelulosa o se irradia con luz ultravioleta si es de nylon.
El ADN se somete a una electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos según su tamaño. En el gel, se coloca un marcador de tamaños como referencia e incorporamos un agente intercalante fluorescente, para fotografiarlo al terminar la electroforesis, iluminándolo con luz ultravioleta. Esta fotografía permitirá comparar el patrón de bandas de ADN obtenido tras la digestión con el resultado de la hibridación.
- Cuando se trabaja con ADN genómico, se observa una estela fluorescente continua o smear debido al elevado número de fragmentos.
- Cuando se trabaja con moléculas pequeñas, como plásmidos, se observan patrones con un número reducido de bandas.