DIARIO ACC

ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS ALIMENTOS

SARA GONZÁLEZ GARCÍA

DIARIO DE MISIÓN DIGITAL

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RETO 1 MISIÓN ACC-SPE

¿QUÉ ES LA SPE?

La Extracción en Fase Sólida (SPE), se trata de una de las técnicas de preparación de muestra más empleadas tanto para muestras líquidas como sólidas en disolución. Se basa en extraer los compuestos de nuestro interés mediante su retención sobre un adsorbente sólido.Se realiza en cartuchos o columnas que contienen un material adsorbente (partículas esféricas o irregulares con un tamaño de partícula mayor). El tipo y cantidad de estos en los cartuchos es variable según las distintas necesidades analíticas. Sin embargo, existen otras opciones para llevar a cabo la técnica además de los cartuchos,como son los discos, puntas de pipeta o placas de 96 pocillos. Estas últimas son cada vez más utilizadas debido a que permiten una fácil automatización.La principal diferencia de los discos SPE con respecto a los cartuchos son sus dimensiones, lo que hace que permitan un flujo de trabajo mayor y por tanto la extracción sea más rápida.

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Carga de la muestra

Acondicionamiento

Pre-tratamiento de la muestra

ETAPAS

Dependiendo de diversos factores como la naturaleza de la muestra, del analito... en algunas ocasiones será necesario llevar acabo previamente una serie de etapas como por ejemplo, ajustes de pH, filtración...

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Se introduce la muestra en el cartucho con el adsorbente anteriormente acondicionado. Los analitos quedan retenidos.

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Evaporación o concentración

Elución de los analitos

Lavado

ETAPAS

Eliminacion de las impurezas retenidas en la etapa anterior, se utiliza un solvente débil para que el analito de interés no sea extraido.

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Se evapora el eluato que contiene el analito, concentrando el compuesto que se quiere analizar.

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Se utiliza un solvente que anule las interacciones entre el adsorbente y el analito. Es importante conseguir que el volumen de elución sea lo menor posible para garantizar una buena concentración de analito.

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1.SOLVENTE

sustancia que puede disolver otras moléculas y compuestos, a los que se les conoce como solutos.

5.ADSORBENTE

4.ELUCIÓN

3.ANALITO

2.ELUATO

sustancias que migran a través del lecho de la fase estacionaria (impulsadas por la fase móvil) dentro de un sistema de separación cromatográfico.

sustancia, la cual puede ser un ion, un elemento, o incluso un compuesto determinado, que posee un interés en nuestra muestra, pues es la parte que deseamos analizar.

GLOSARIO

proceso de extraer un material de otro lavando con un solvente.

sustancia que adsorbe (atrae y retiene partículas de otro cuerpo).

• Majors, R. E. (2013). Sample preparation fundamentals for chromatography. Agilent Technologies, Mississauga, Canada.

• Valls Puig, Jaime. (2004). Extracción en fase sólida (SPE) para tratamiento de muestras de alimentos para análisis por cromatografía.. 10.13140/RG.2.2.16345.52325.

• http://www.cromlab.es/efs_principal.htm

BIBLIOGRAFÍA

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Reto 2Misión ACC-SPE

R. Mateos, S. Vera, A.M. Díez-Pascual, M.P. San Andres, Graphene solid phase extraction (SPE) of synthetic antioxidants in complex food matrices, J. Food Compos. Anal. 62 (2017) 223–230.

Extracción en fase sólida de grafeno (SPE) de antioxidantes sintéticos en matrices de alimentos complejos

Antioxidantes naturales más utilizados: ácido ascórbico y sus derivados, los tocoferoles, las lecitinas o las sales de ácido láctico, maleico y tartárico.Antioxidantes sintéticos más comunes: BHA (varios estudios demuestran su toxicidad), BHT (similar al BHA ; carcinogenicidad y efectos perjudiciales para la salud), galato de propilo , etoxiquina (no autorizado en productos alimenticios, sin embargo existe un riesgo debido a su exceso en tejidos animales ingeridos).

INTRODUCCIÓN

ANTIOXIDANTES: subgrupo de conservantes, esenciales para prolongar la vida útil de los alimentos. Forman un grupo de compuestos que pueden inhibir la oxidación lipídica dependiente del oxígeno. La extracción en fase sólida (SPE) es la técnica de extracción más utilizada para el tratamiento de muestras debido a varias ventajas: - Gran número de sorbentes disponibles comercialmente. - Bajo consumo de disolventes. - Rápida y respetuosa con el medio ambiente. - Alto factor de preconcentración utilizando solo unos pocos ml de disolvente orgánico. Sin embargo, los estudios sobre la extracción de alimentos por parte de SPE son muy escasos. El grafeno tiene mucho interés debido a su increíbles propiedades electrónicas, térmicas y mecánicas, por lo que puede convertirse en un sorbente de alto rendimiento para SPE. OBJETIVO: evaluar, por primera vez, la eficacia del grafeno como absorbente para la extracción de antioxidantes sintéticos, PG y BHA, a partir de matrices complejas de muestras de alimentos.

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La determinación de antioxidantes sintéticos en muestras de alimentos requiere un paso de tratamiento antes del análisis de la muestra para eliminar posibles interferencias, aislar analitos en un medio adecuado, limpiar la matriz de la muestra y preconcentrar los antioxidantes.

Se realizaron 4 análisis a cada muestra

Espaguettis carbonara precocidos Caldo de verduras sin antioxidantes

MUESTRAS

MATERIALES Y METODOS

1. Optimización de fase móvil RP-HPLCPara la optimización de la fase móvil, se probaron diferentes proporciones de ACN/H3PO4 1% (v/v) para obtener la mejor resolución en el tiempo de análisis más corto.Las concentraciones de antioxidantes oscilaron entre 0,08 y 15 mg L−1 para determinar la sensibilidad, el rango lineal, el límite de detección (LOD), el límite de cuantificación (LOQ), la reproducibilidad y la repetibilidad.2. Preparación de cartuchos de extracción de grafeno Los cartuchos de grafeno SPE se prepararon a partir de cartuchos comerciales , rellenando los cartuchos con una masa del nanomaterial de carbono:- Se acondicionaron con 5 ml del eluente y 5 ml de agua. - Las soluciones de una mezcla de antioxidantes se pasaron lentamente y los cartuchos se limpiaron con 2 ml de agua para eliminar los componentes de la matriz. - El eluente se pasó a través del cartucho y se inyectó 20 μL del eluado en el sistema cromatográfico. - El cartucho se limpió con 10 ml de metanol y se acondicionó de nuevo para la siguiente extracción.

PROCEDIMIENTO

*Factores que afectan al rendimiento de la extracciónSe investigó el efecto de varios factores en el rendimiento de la extracción:A partir de 25 ml de una muestra que contenía PG y BHA, se eligieron dos disolventes ACN y MeOH como eluentes, y se probaron tres volúmenes de elución (5, 10 y 25 ml), dos cantidades de grafeno (5 y 10 mg) y tres volúmenes de muestra (25, 50 y 100 ml). También se estudiaron a disferentes concentraciones de antioxidantes.El rendimiento de extracción obtenido en condiciones óptimas con el cartucho grafeno se comparó con cartuchos SPE comerciales, sílice, C18 y HLB polimérico.3. Preparación de la muestra- Pesar 2 g de la muestra de espagueti carbonara precocida.- Diluir en 100 ml de agua y ultrasonizar para su homogeneización.- Centrifugar durante 15 minutos y añadir 10 ml de TCA al sobrenadante, despúes mantener en la nevera durante 30 minutos. - Centrifugar la muestra para eliminar las proteínas y pasar 50 ml del sobrenadante a través de los cartuchos G y HLB en las mismas condiciones. - Eluir los antioxidantes con 10 ml de ACN e inyectar 20 μL del eluido en el sistema cromatográfico para cuantificar los antioxidantes. - 1 g del cubo de caldo de verduras se picó con dos cantidades diferentes de cada estándar antioxidante. - La muestra se disolvió en 100 ml de agua caliente, se realizó por ultrasonido durante 10 minutos y se centrió durante 15 minutos. - Se filtró con papel y se pasaron 50 ml a través del cartucho G. Los antioxidantes se eluyeron con 10 ml de ACN y se inyectaron 20 μL del eluado en el sistema HPLC.

PROCEDIMIENTO

- ESPAGUETIS CARBONARA PRECOCIDO Y CALDO DE VERDURAS SIN ANTIOXIDANTES.Según la etiqueta de los espaguetis, estos contenían antioxidantes y su cantidad se determinó después de la extracción de las proteínas, la centrifugación, el paso a través del cartucho SPE de grafeno y la inyección del eluado en el sistema cromatográfico. A su vez, se utilizó otro cartucho HLB para comparar ambos resultados.Si se observan los cromatogramas obtenidos después de pasar las muestras de alimentos a través de los cartuchos sin (líneas sólidas) y con la adición de estándares antioxidantes (líneas discontinuas). (a) y (b) corresponden a la matriz de carbonara de spaguetti después de la extracción con el cartucho G (a) y HLB (b), respectivamente; (c) corresponde a los caldos de verduras que utiliza G como fase sólida.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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Se puede concluir que el eluado del cartucho de grafeno es significativamente más limpio que el polimérico. Sin embargo al filtrar la mezcla, se detecta una disminución drástica en la altura de los picos, por lo que el paso de filtración es muy importante en el análisis preciso de la muestra. El cartucho de grafeno proporciona un extracto limpio que se puede inyectar directamente en el sistema cromatográfico. El cromatograma obtenido muestra claramente los picos de los antioxidantes, aunque la concentración encontrada está por debajo de la LOQ del método. Por lo tanto, el cartucho SPE de grafeno es adecuado para el análisis de este tipo de muestra. En los espaguetis carbonara, los LOD para PG y BHA, y los LOQ están muy por debajo de los límites legales. La concentración de los antioxidantes en los espaguetis carbonara está muy por debajo de la LOQ del método y del límite legal de antioxidantes permitidos en la mayoría de los países del mundo.La muestra del caldo de verduras está libre de antioxidantes sintéticos, aunque contiene antioxidantes naturales (extracto de romero) que son menos efectivos y menos peligrosos que el PG y el BHA. Los antioxidantes se añadieron a los caldos de verduras en dos cantidades diferentes, una en el límite legal y la otra por debajo de este límite.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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Por primera vez, el grafeno se ha utilizado como sorbente para la extracción en fase sólida de antioxidantes fenólicos sintéticos como PG y BHA. La optimización de los diferentes parámetros que influyen en el proceso de extracción permitió obtener altos rendimientos de extracción: muy cerca del 100 % para BHA y alrededor del 80 % para PG. El cartucho G se puede usar al menos 20 veces sin perder su capacidad de absorción. El método SPE-RP-HPLC desarrollado es adecuado para la cuantificación de PG y BHA en matrices complejas de muestras de alimentos mediante la inyección directa del extracto en el sistema cromatográfico. En general, los resultados sugieren que el grafeno, puede considerarse como un material muy adecuado para el proceso de extracción de antioxidantes fenólicos sintéticos.

CONCLUSIONES

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Reto 3Misión ACC-SPE

En un laboratorio de control de calidad de alimentos se lleva a cabo la determinación de un antibiótico en una muestra de carne. Para ello, se procede del siguiente modo: se pesan 2 g de carne picada previamente triturada y homogenizada, que se mezclan con 10 mL de acetonitrilo.La mezcla se deja agitar 5 min en ultrasonidos y después se centrifuga 10 min a 6000 rpm. El sobrenadante se recoge en un tubo falcon, mientras que el residuo sólido vuelve a ser sometido a una segunda extracción con 5 mL de acetonitrilo:agua (3:1, v/v), se agita 5 min en ultrasonidos y se centrifuga 5 min a 6000 rpm. El sobrenadante resultante se junta con el primero recogido en el tubo falcon, mientras que el residuo sólido se descarta. A continuación, se añaden 20 mL de hexano en el tubo falcon, se agita y se añade la mezcla a un embudo de decantación, el cual se vuelve a agitar y se deja reposar. Transcurridos unos minutos, se observa la separación de fases, se descarta la fracción de hexano y se recupera el resto. De la fracción recuperada se toma una alícuota de 10 mL y se ajusta a pH 10 con una disolución de amoníaco. A continuación, dicha alícuota se purifica por extracción en fase sólida utilizando un cartucho de tipo MAX de 200 mg.El cartucho se acondiciona primero con 2 mL de agua, seguido de 2 mL de acetonitrilo:agua (3:1, v/v) a pH 9,0. Después, se carga la muestra a un flujo de 1 mL/min, y después se pasan 5 mL de agua por el cartucho de extracción para eliminar las impurezas. El cartucho se deja secar a vacío durante 5 min y finalmente se lleva a cabo la elución del analito con 4 mL de acetonitrilo acidificado a pH 2,0 con ácido fórmico. el Extracto purificado se lleva a sequedad mediante corriente de nitrógeno y se reconstituye en 300 µL de fase móvil y se hace reaccionar con orto-ftaldialdehido (OPA). El producto resultante se inyecta en un cromatógrafo de líquidos acoplado a un detector de fluorescencia, obteniendo el cromatograma que se muestra en la imagen. Tras el análisis, el área obtenida se interpola un su calibrado correspondiente y se obtiene una concentración de antibiótico de 10 ng/mL.

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1. ¿Cuál es la concentración de antibiótico en la muestra de carne inicial expresada en µg/Kg y sabiendo que el porcentaje de recuperación de todo el proceso es del 70%?Planteamiento del problema:2 g de carne picada + 10 mL de acetonitrilo Agitación + Centrifugación Residuo sólido Sobrenadante5 mL de acetonitrilo:agua (3:1, v/v). Tubo falcon + 20 mL hexano Agitación + embudo de decantación Agitación + Centrifugación Fracción recuperada Fracción Hexano Residuo sólido Sobrenadante Alicuota 10 mL + ajuste pH 10 SPE (cartucho Max 200 mg)HPLC-fluorescencia Recontruir con 300µL de fase móvil + OPA Sequedad Elución con 4 mL de acetonitrilo acidificado

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1. ¿Cuál es la concentración de antibiótico en la muestra de carne inicial expresada en µg/Kg y sabiendo que el porcentaje de recuperación de todo el proceso es del 70%?En primer lugar utilizamos la recuperación del proceso:A continuación, mediante las volumenes anteriores, calculamos la concentracion inicial (C1), a través de la siguiente fórmula:

2. ¿Qué tipo de cartucho de SPE se utiliza? ¿Qué propiedades tiene? ¿Cómo será su interacción con el analito? ¿Es selectivo? Justifica y razona las respuestas.Como se puede observar en el enunciado del problema en esta extracción se utiliza un cartucho de tipo MAX ( mixto de intercambio iónico). Se trata de un adsorbente polimérico en modo mixto de fase reversa que se llevó a cabo para lograr una. mayor selectividad y sensibilidad para extraer compuestos ácidos con grupos de intercambio aniónico. Además tiene un tipo de efecto hidrofóbico.Este sorbente esta compuesto por partículas monodispersas de resina de poliestireno-divinilbenceno injertadas con grupos aromáticos de amonio cuaternario.Una de las principales aplicaciones de este cartucho es para la determinacion de pesticidas residuales/ medicamentos veterinarios en alimentos como ocurre en este caso.La interacción con el analito va a ser de tipo electrostático, debido a que se trata de un intercambio aniónico. Por lo tanto, el analito quedará retenido en el material.3. ¿Por qué se ajusta el pH antes de la SPE? ¿Por qué se eluye a pH 2,0? Justifica y razona las respuestas.Al principio es importante que se ajuste el pH ya que debemos conseguir que nuestro analito interaccione con la columna, por ello lo conseguimos mezclando el disolvente alcalino (amoniaco) con el analito, asegurandonos de que tenga carga positiva. Después, se eluye hasta pH 2, es decir, un pH ácido, debido a que se debe tener unas condiciones de pH adecuadas para poder eliminar la interaccion entre el analito y el sorbente. Anteriormente, se ha mencionado que el cartucho utilizado era para separar compuestos ácidos con grupos de intercambio aniónico.

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4. ¿Por qué se adiciona hexano? ¿Qué tipo de extracción se está realizando en esta parte del protocolo? Justifica y razona las respuestas.Se adiciona hexano como etapa de limpieza, es decir, para eliminar la grasa que pueda contener el sobrenadante y que después pueda interferir en la determinación. Además, muchos antibióticos son insolubles en hexano, por lo que es un método de separación.Se trata de una extración líquido-líquido, ya que pasamos el analito de una muestra líquida a otro líquido como es el hexano que es un disolvente orgánico. Además, como se ha mencionado antes, la gran parte de los componentes de la muestra son insolubles en este disolvente. Se trata de una extracción simple ya que se utiliza un embudo de decantación para realizar la extracción.5. ¿Se produce preconcentración en alguna etapa del proceso? Justifica y razona las respuestas.Sí, se produce preconcentración cuando se reconstruye en 300µL de fase móvil. Ya que se eluye con 4mL y se reconstruye con 0,3 mL, por lo que se ha producido una cocnentración del analito. También, se produce otra preconcentración antes de la SPE y depués, ya que tenemos una alicuota de 10 mL, y después de la extracción, eluimos con 4mL.

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6. ¿Por qué se adiciona orto-ftaldialdehido (OPA) a la muestra antes de inyectarla en el cromatógrafo? ¿Qué función tiene este compuesto? Justifica y razona las respuestas.Sirve como reactivo derivatizante, es decir, va a reaccionar con el antibiótico que queremos determinar para que se vuelva fluorescente, ya que este no sera fluorescente de manera natural.Es necesario el proceso de derivatización ya que vamos a utilizar un HPLC acoplado a un detector de fluorescencia, por lo que si no llevamos acabo este proceso no se podría utilizar este método, ya que no veriamos nada en el cromatógrafo.7. ¿Qué tipo de detector se emplea en este método? ¿Es adecuado para el tipo de analitos?¿Qué otro detector podría emplearse para la detección y cuantificación de los compuestos? Justifica y razona las respuestas.Un detector de fluorescencia. Si no se lleva acabo el proceso de derivatización no sería muy adecuado, ya. que los antibióticos no son fluorescentes de forma natural. Otra alternativa que se podía utilizar sería una cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas.8. Según las condiciones cromatográficas, ¿la separación del analito se lleva a cabo en fase reversa o en fase normal? ¿Crees que el modo cromatográfico empleado es el adecuado? Justifica y razona las respuestas.Se trata de una separación en fase normal, debido a que la fase móvil (n-heptano/ Diisopropil éter/ octanol) es apolar, y la fase estacionaria (columna de sílice) es polar. Es cierto que mayoritariamente se utiliza más la fase reversa, que la normal debido a la complejidad de esta. Pero observando el cromatograma, se puede ver que ha salido bien y "limpio", por lo que si es adecuado.

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Reto 4Misión ACC-SPE

DETERMINACIÓN DE ANTIBIOTICOS EN MUESTRAS DE LECHE

El objetivo del experimento es determinar posibles fármacos en muestras de leche, como por ejemplo la presencia de sulfonamidas. Se utiliza en forma de antibióticos para los animales, aunque también son sustancias promotoras del crecimiento, cosa que el uso de antibióticos con esta finalidad esta prohibido. Además, presenta problemas para la salud de las personas, por lo que la UE establece un LMR de 100 µg/kg de la suma total de ellas.En el siguiente experimento se llevará a cabo la determinación , y en cierto caso la cuantificación de esta sustancia para ver si existe un posible fraude.

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Este tipo de experimentos requieren normalmente la extracción previa de las sulfonamidas con disolventes orgánicos o su purificación mediante técnicas de extracción en fase sólida (SPE), como en este caso.

PLANTEAMIENTO DEL EXPERIMENTO

2 mL de leche + 2mL de tampón acetato (pH 5,2) + 2,5 mL de metanolAgitación (1 min) + Centrifugación (4000 rpm / 5 min) Residuo sólido SobrenadanteAgua Milli-Q ( 2 veces / 5 mL) Matraz aforado Enrasar a 25 mL SPE* Evaporar y reconstruir en 2 mL de MeOH Agitación + Centrifugación HPLC-fluorescencia Residuo sólido Sobrenadante

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Para la purificación puede aprovecharse el carácter básico (sulfonamidas) de los fármacos y usarse SPE de intercambio iónico.

PROCESO DE SPE

1. ACONDICIONAMIENTO - 4 mL MeOH - 4 mL agua2. MUESTRA: introducimos la muestra.3. LAVADO: 5 mL de agua, para eliminar las impurezas de la etapa anterior.4. ELUCIÓN: 4 mL de MeOH.

PROCEDIMIENTO CROMATOGRÁFICO

Se llevo a cabo en HPLC/Fluorescencia , en fase reversa. La fase estacionaria: a polar, y la fase móvil: polar.Debido a que la sulfonamida no presenta una fluorescencia nativa, es necesario realizar un proceso de derivatización con un reactivo apropiado, para que los compuestos de interestatal se vuelvan fluorescentes y poder llevar a cabo el proceso correctamente.Además de la detección por fluorescencia, existen otros métodos como el detector de MS, que es otra buena opción para determinar sulfonamidas , aunque la fluorescencia prevalece debido a que es más selectiva.

La separación de las sulfonamidas se lleva a cabo en un tiempo menor a los 15 minutos. Para ello, previamente los compuestos de interés han tenido que ser modificados, mediante una etapa dederivatización mediante la formación de un derivado fluorescente ya que las sulfonamidas no presentan fluorescencia nativa. El método HPLC-FL ha sido caracterizado en cuanto a sus parámetros decalidad y validado para el análisis de muestras de leche, obteniéndose unoslímites de detección y cuantificación muy por debajo de los valores establecidospor la legislación como límite máximo de residuos de sulfonamidas enalimentos.El método es rápido, simple al combinar las ventajas del método SPE, con las ventajas de la cromatografía líquida (HPLC) (gran sensibilidad, determinaciones cuantitativas exactas...) y la fluorescencia. Es cierto que se podría utilizar HPLC-MS, y evitar la etapa de deprivatización, pero la fluorescencia es mas selectiva.

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